實驗七 血中一氧化碳的檢測
【目的要求】
熟悉一氧化碳中毒的特征和檢材的采取要點，掌握碳氧血紅蛋白分析鑒定方法，及飽和碳氧血紅蛋白的制取技術(shù)。
【實驗內(nèi)容】
一、檢材的采取
一氧化碳中毒檢材以取血液為最好，通常是采取心腔內(nèi)血液進行檢測。死體采血應用針管先將血漿和血球充分混勻后抽取。盛裝檢血的容器如不能及時檢測，應待檢血裝滿不要留有空間以避免一氧化碳的損失。
二、碳氧血紅蛋白的鑒別試驗
1、煮沸法
取血2~3毫升，置試管內(nèi)，放水浴鍋中加熱，使發(fā)生凝固。如系一氧化碳血，呈磚紅色凝固體，而正常血則呈褐色或黑褐色凝塊。
此法最簡便，不需任何試劑，在勘驗現(xiàn)場即可進行，但含量在40%才可測出。
2、硫化銨法
取水10毫升，加血5滴，加硫化銨5滴，輕混合之，再加少量10%醋酸使微呈酸性，如系一氧化碳血，呈玫瑰色；而正常血為綠褐色。
此法靈敏，含量在10%即可檢出。
3、堿液稀釋法
取血1~2滴，加水稀釋至15毫升，再加5滴10%氫氧化鈉，同時取一正常血樣作對照，與堿液混合后立即記下時間，正常血由于堿性正鐵血紅素的形成，立即變?yōu)椴菥G色或綠褐色而含10%以上一氧化碳血液需要15秒鐘后才變?yōu)椴菥G色或綠褐色；含50%者需50秒鐘后。
4、鈀鏡試驗
碳氧血紅蛋白與硫酸作用釋放出一氧化碳，一氧化碳可使氣體鈀還原成鈀鏡。
取擴散血（孔威氏盒)一個，內(nèi)圈內(nèi)放入0.5毫升0.1%氯化鈀溶液，外圈內(nèi)一側(cè)放入0.5毫升檢血，另一側(cè)放入0.5毫升10%硫酸溶液（封蓋前不要讓它們接觸)，然后蓋上盒蓋，輕輕搖晃使血液與硫酸充分接觸，20分種至2小時內(nèi)觀察試驗結(jié)果，如有一氧化碳釋出，可見內(nèi)圈形成發(fā)亮的鈀鏡。
以上各鑒別試驗，一定要取正常血同樣做對照試驗，以作對比。
三、碳氧血紅蛋白的定量檢驗
1、焦性沒食子本----鞣酸法測定一氧化碳含量
含碳氧血紅蛋白血與焦性沒食子酸----鞣酸溶液混合靜置觀察，呈櫻紅色。而正常血變?yōu)榛液稚�。此反應較慢，但反應顏色可保持數(shù)日，利用它可做碳氧血紅蛋白念量測定。
（1)實驗室中飽和碳氧血紅蛋白 制備；
實驗裝置見圖2-1：
先將濃硫酸加熱，而后扭開分液漏斗活塞，讓甲酸（H COOH)一滴一滴與濃硫酸接觸，即有一氧化碳氣體冒出，經(jīng)過洗氣瓶，通入盛有正常血的瓶中，10毫升血（用0.05克枸椽酸鈉作抗凝劑)通一氧化碳約15分鐘，即可使血紅白的一氧化碳飽和度達100%。避免通氣過猛，以免血液內(nèi)產(chǎn)生大量泡沫外溢。因每人Hb含量不同，最好取死者血通以CO使達飽和，可省去換算。
（2)焦性沒食子酸----鞣酸性測定血中一氧化碳含量：取正常血3毫升，加水稀釋至30毫升，另取上述制備之飽和一氧化碳血3毫或，加水稀釋至30毫升，按下表之比例取這兩種混合，得到一氧化碳由百分之0至100飽和度的血。
分別取一氧化碳不同飽和度的血各毫升，放入11支口徑相等的5—10毫升的小試管內(nèi)，每管加入2毫升焦性沒食子本----鞣酸溶液，塞住管口，將管倒轉(zhuǎn)2---3次，使溶液混勻，但勿振蕩，管置冷水中冷卻，傾入少量熔化的石蠟，使凝固于液面上，隔絕空氣。標準管可保存1---2星期。加試藥后，正常血變灰色，合一氧化碳的血變櫻紅色，含量愈多，顏色愈深。
取中毒者的血0.2毫升加水稀釋10倍，同時加2毫升焦性沒食子酸----鞣酸溶液處理30分種后，與標準管比色，以求一氧化碳飽和度。
CO飽和度（%) | CO血（毫升) | 正常血（毫升) |
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 | 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0 | 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 |
圖2-1 一氧化碳發(fā)生裝置
2、氧化鈀法測定血中一氧化碳含量
此法依據(jù)的原理為鐵氰化鉀能使碳氧血紅蛋白釋出一氧化碳。一氧化碳氣體通過氯化鈀反應紙，二價的鈀被一氧化碳所還原，析出黑色的金屬色；在反應紙上形成色斑，與標準色斑比對測定其含量。
操作方法，裝置如圖2-2。其中包括三個大試管（15×2厘米)，一套凸緣雙聯(lián)吸收管（內(nèi)徑1厘米)及一個抽水吸引器（“E”字母代表)。
圖2-2 氯化銫法測定一氧化碳裝置
A管裝5毫升氯化鈀溶液，以除去空氣中的一氧化碳。B管裝2毫升供檢驗的血，加4毫升鐵氰化鉀溶液，再加2滴辛醇醫(yī)學全.在線m.zxtf.net.cn以防止抽氣時血液起泡，并加20毫升乳酸溶液。C管裝玻璃珠至4厘米高，加5毫升5%醋酸鉛溶液，以除去血液因腐敗而含的硫化m.zxtf.net.cn/zhicheng/氫。取一圓形濾紙，大小與吸收管（D)外徑一致，浸入氯化鈀溶液浸濕，夾于另兩張干凈濾紙問吸去多余的溶液，否則氣體不易通過。謹慎地將濾紙夾入吸收管中。用橡皮圈緊密固定，切勿漏氣。
吸收管與抽水吸引器（E)連接，打開進氣管處螺旋S，由抽水吸引器緩緩抽吸，可見氣泡通過，抽15分鐘后停止。如無抽水吸引器，可用一個具有下口的體積為2升的大瓶代替，內(nèi)盛滿水，打開下口，調(diào)節(jié)水的流速度使15分鐘流出400毫升，即行停止亦可。自吸收管間取出濾紙，放蒸餾水充分沖洗，以除去未被還原的氯化鈀。紙上色斑與標準色斑比對，確定其含量。
標準色斑的制備：如前面所述制備一氧化碳飽和度為0、10、20……100的11個標準樣品，以氯化鈀法制備11個標準色斑，水洗。干燥后，夾于玻璃板中。保存于陰暗處，避免陽光直接照射，可數(shù)月不變色。
做標準色斑有的血所含血紅蛋白如與供測定的血所含血紅蛋白相等，所得飽和度百分數(shù)即無須校正，否則予以校正。
例如，做標準用血含血紅蛋白為90%，供測定的血紅蛋白為60%，比色所得色斑相當于標準色斑30%一氧化碳飽和度。校正后供測定的血的一氧化碳飽和度應為：
90
30×————45%
60
3、紫外吸收光譜法測定血中一氧化碳含量
一氧化碳測定亦可用微量擴散法。擴散后，槽內(nèi)氯化鈀液可用來測光密度以推算一氧化碳含量。
操作方法：
（1)在微量擴散槽沿上涂抹薄層硅潤滑沒（防止漏氣)。
（2)在微量擴散槽中央加3毫升0.005N氯化鈀溶液。
（3)在外槽一側(cè)滴加1毫升3.5N硫酸，將蓋蓋上只留一側(cè)邊縫準備滴加被檢血液。
（4)加0.5毫升血，立即將蓋封閉嚴密，利用旋轉(zhuǎn)傾斜使外槽的硫酸和血液混合，開始擴散。
（5)室溫擴散2小時后，取出內(nèi)槽氯化鈀液，移到50毫升容量瓶中，并用0.1N鹽酸3毫升洗滌3次，洗液均并入容量瓶中，用0 .1N鹽酸稀釋至刻度，混勻后，用1厘米厚石英杯9毫微米光密度，將0.1鹽酸作參比液。測得的光密度為剩余未被一氧化碳化原的氯化鈀溶液的光密度，將它與標準氯化鈀溶液的光密度對比，從而推算一氧化碳的含量。
標化和計算：
（1)分別將0.5、1.0、2.0、2.5和3.0毫升0.005N氯化鈀用0.1N鹽酸稀釋至50毫升，充分混勻。
（2)同上用1厘米厚石英杯測各個不同濃度的氯化把溶液在2：3毫微粉的光密度。
（3)氯化鈀的用量與血中一氧化碳體積的相關(guān)值可見下表。
氯化鈀的體積 （毫升/50毫升) | 一氧化碳的體積 （毫升/100毫升) |
3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 | 0 5.6 11.2 16.8 22.4 28.0 |
(4)測定原檢材的血紅蛋白合量，然后按下試計算：
CO的體積×100
————————————————= CO血紅蛋白飽和度（%)
血紅蛋白（克/100毫升)×1.35
此法系數(shù)變動范圍為±5.2%
如血液腐敗，其中大量硫化物能干擾本反應，可用醋酸沿溶液代替3.6N硫酸作為釋放劑，以除去硫化物的干擾。
附：試劑
1、1%氯化鈀溶液：0.5克氯化鈀加0.5毫升濃鹽酸，加水稀釋至50毫升。
2、焦性沒食子酸----鞣酸溶液：焦性沒依酸和鞣酸各0.5克，溶于50毫升水中（以臨用時新配制為宜)。
3、鐵氰化鉀溶液：3.2 克鐵氰化鉀及0.8克皂角甙（皂素Saponin)溶于100毫升水內(nèi)。
4、乳酸溶液：100這種升水含乳酸（比重1.20)0.8毫升。
5、0.005N氯化鈀溶液：0.44克氯化鈀溶于500毫升0.1N鹽酸中，過夜，用0.1N鹽酸稀釋至1升。1毫升0.005N氯化鈀相當于0.056毫升一氧化碳。
6、醋酸鉛醋酸溶液：10毫升冰醋酸溶于100毫升水，加醋酸鉛至飽和為度。
