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2.3.1 對照組SP-C和AQP5 mRNA的表達情況
對照組于第1、5、8天檢測AQP5和SP-C mRNA的表達情況。在共培養(yǎng)開始第1天，可檢測到AQP5的mRNA表達，但AQP5的表達比較弱，不同時間段差異不明顯，而在不同時間段SP-C都沒有表達(圖5)。
2.3.2 實驗組A SP-C和AQP5 mRNA的表達情況
實驗組A所檢測到的SP-C和AQP5 mRNA的表達情況與對照組觀察結果相似(圖6)。
2.3.3 實驗組B不同時間段SP-C和AQP5 mRNA的表達情況
實驗組B在共培養(yǎng)的各時間段可同時檢測到AQP5和SP-C mRNA的表達(圖7，圖8)。
2.3.4 不同實驗處理組中AQP5和SP-C mRNA的表達量的比較
對照組和實驗組A各時間點均未見SP-C mRNA的表達，而在實驗組B于共培養(yǎng)的第1、5、8天的SP-C mRNA的表達量分別為1599.00±158.95、2066.80±101.30、3893.00±178.60。不同處理組的AQP5 mRNA的表達量見表1。實驗組B各時間點AQP5 mRNA的表達量與對照組比較，AQP5 mRNA的表達量明顯增多(F=78.61，P<0.01)，而與實驗組A的AQP5 mRNA的表達量比較，也有統(tǒng)計學差異(F=67.38，P<0.01)。但是，實驗組A各時間點則與對照組比較無明顯統(tǒng)計學差異(F=1.45，P>0.05)。表1 不同處理組AQP5mRNA的表達量的比較(略)
3 討 論
AECⅡ具有分泌肺泡表面活性物質、調節(jié)肺泡表面張力、維持肺液體平衡和多種防御功能，不僅可以修復肺泡的正常結構，更可以有效地恢復功能，從而阻止和修復肺損傷[5]。因此，體外或者體內誘導干細胞分化為AECⅡ一直是肺損傷修復的一個研究熱點。研究表明，SP-C是AECII細胞表達的特征性蛋白，AECⅡ細胞可能是AECI的祖細胞，當AECⅡ可以轉化為AECI后，獲得AECI的表型特征AQP5，同時失去AECⅡ的表型標志SP-C[6]。因此，本實驗選用SP-C和AQP5兩個特異性蛋白來鑒定干細胞誘導分化為肺泡上皮細胞的效果。
本實驗建立的懸掛式體外非接觸共培養(yǎng)小室，當MSCs單獨靜置培養(yǎng)時，或者與正常肺組織單細胞懸液共同培養(yǎng)時，在共培養(yǎng)的全部時段，都未檢測到AECⅡ表達的特征性蛋白SP-C的表達，說明干細胞都沒有轉換為AECⅡ或者轉化為AECⅡ細胞的數(shù)量非常少。該兩種情況下都有AQP5的表達。而且，AQP5的表達量也沒有變化。KOTTON[7]及其同事的研究發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的MSCs可表達AECI的特異性標記物AQP5，這種細胞亞型可能是肌細胞、骨細胞和脂肪細胞的多潛能干細胞。推測所檢測到的AQP5表達是MSCs自身表達的結果，MSCs沒有向AECI分化。而損傷肺組織與MSCs共培養(yǎng)時，不但有SP-C的表達，而且隨著時間的延長，表達量逐漸增加，說明MSCs成功轉換為AECⅡ;同時，AQP5表達量明顯高于實驗組A和對照組。我們推斷AQP5表達量增加部分是由AECⅡ細胞轉化為AECI細胞引起的或是MSCs直接分化為AECI。這與文獻報道的用博來霉素導致小鼠肺損傷時，靜脈注射外源性的MSCs，在受體小鼠肺中，比骨髓間充質干細胞移植前，MSCs總的DNA的含量升高23倍，同時AECⅡ的含量升高3倍的研究結果一致[8]醫(yī)學全.在線m.zxtf.net.cn。
骨髓間充質干細胞具有多向分化潛能，在不同的環(huán)境、不同的培養(yǎng)液中可以分化為多種細胞，如成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肌細胞、肝細胞、神經元樣細胞、表皮細胞、血管內皮細胞等[9]。一種理論認為組織及器官損傷可以被干細胞感知，遷移到損傷部位并分化為器官特異的細胞，以修復損傷器官的結構和功能[10]。本研究通過非接觸共培養(yǎng)，采用聚碳酸脂膜將損傷肺組織與干細胞分開，使損傷肺組織細胞不能通過，而細胞分泌的細胞因子可以自由通過，成功建立了體外非接觸共培養(yǎng)誘導骨髓間充質干細胞分化為肺泡上皮細胞的模型，驗證了該理論的正確性。研究報道，之所以損傷細胞能夠誘導MSCs分化為損傷特異性的細胞，可能是因為損傷細胞分泌的特殊的細胞因子刺激MSCs或者是損傷細胞激活某個信號傳導[2]。本研究中MSCs分化為肺泡上皮細胞的具體機制需要進一步的研究。
采用骨髓間充質干細胞在細胞替代治療、基因治療以及組織器官的再造中具有重要的臨床應用價值。骨髓采集方便、安全、損傷小，供者無明顯并發(fā)癥，有利于體外擴增和自體回植。本研究成功建立了體外誘導MSCs分化為肺泡上皮細胞的模型，有望為臨床建立永不枯竭的肺細胞和組織來源，以修復和取代受損傷的肺組織和細胞，為根本性治療肺損傷提供實驗基礎。
【參考文獻】
1]WANG W, QIAN LL, SUN S, et al. Engraftment of bone marrow stromal cells in lipopolysaccharide-injured mouse lungs [J]. Zhongguo Dangdai Er Ke Zazhi, 2009, 11(5):321-327.
[2]ROJAS M, XU J, WOODS CR, et al. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells in repair of the injured lung [J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 2005, 33(2):145-152.
[3]POPOV BV, SERIKOV VB, PETROV NS, et al. Lung epithelial cells induce endodermal differentiation in mouse mesenchymal bone marrow stem cells by paracrine mechanism [J]. Tissue Eng, 2007, 13(10):2441-2450.
[4]朱翠平，杜江，封志純. 角化細胞生長因子在地塞米松干預高氧新生鼠肺組織的表達 [J]. 中華圍產醫(yī)學雜志, 2006, 9(3):181-184.
[5]陳慧，王振花，張建平，等. 胎鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞分離、原代培養(yǎng)與鑒定 [J]. 中山大學學報：醫(yī)學科學版, 2006, 27(5):496-499, 505.
[6]XU W, FU JH, XUE XD. Expression of HoxB5, SPC and AQP5 in neonatal rats with hyperoxia-induced chronic lung disease [J]. Zhongguo Dangdai Er Ke Zazhi, 2009, 11(1):51-55.
[7]KOTTON DN, FABIAN AJ, MULLIGAN RC. Failure of bone marrow to reconstitute lung epithelium [J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 2005, 33(4):328-334醫(yī)學全.在線m.zxtf.net.cn.
[8]ORTIZ LA, GAMBELLI F, MCBRIDE C, et al. Mesenchymal stem cell engraftment in lung is enhanced in response to bleomycin exposure and ameliorates its fibrotic effects [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2003, 100(14):8407-8411.
[9]姚天華，李曉紅，熊曦州，等. 大鼠骨髓間充質干細胞骨向分化及體外誘導實驗 [J]. 西安交通大學學報：醫(yī)學版, 2006, 27(3):233-235,257.
[10]LEVESQUE JP, WINKLER IG. Obilization of hematopoietic stem cells: state of the art [J]. Curr Opin Organ Transplant, 2008, 13(1):53-58.
