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2 實(shí)驗(yàn)方法
2.1 菌懸液的制備和含菌培養(yǎng)基的制備取金黃色葡萄球菌斜面培養(yǎng)物,接種于50 ml營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,置35～37℃培養(yǎng)約18 h,臨用前以營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基為空白在550 nm的波長(zhǎng)處測(cè)定其吸收度,調(diào)整菌液濃度使吸收度為1.0.在抗生素檢定培養(yǎng)基Ⅲ中,加入上述實(shí)驗(yàn)菌液,加入量為1%(每100 ml中加實(shí)驗(yàn)菌液1 ml),搖勻,立即使用。并以未加菌的抗生素檢定培養(yǎng)基Ⅲ為陰性空白。
2.2 線性范圍及線性關(guān)系取慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品適量,精密稱定,用滅菌磷酸鹽緩沖液(pH7.8)制成100 u/ml的溶液,再稀釋制成 1.0、0.8、0.64、0.52、0.41 u/ml溶液,作為線性實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)溶液[5]。取上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液各1.0 ml,置儀器配備的比色管中,再分別加入含菌培養(yǎng)基9.0 ml,搖勻,密塞,放入CZB1抗生素光度測(cè)量?jī)x培養(yǎng)。以不含菌液培養(yǎng)基9.0 ml和1.0 ml無(wú)菌水作陰性空白,以含菌液培養(yǎng)基9.0 ml和1.0 ml無(wú)菌水作陽(yáng)性空白。培養(yǎng)溫度37℃,測(cè)定波長(zhǎng)為530 nm.試驗(yàn)設(shè)定的5個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液劑間比為1∶1.25,從0.4 u/ ml～1.0 u/ ml,吸收度大概在0.2～0.6之間,相鄰劑量間的吸收度差約為0.07,有較明顯的劑間差。以濃度(C,u/ ml)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)X,吸收度(A)為縱坐標(biāo)Y進(jìn)行線性回歸,顯示線性關(guān)系良好,線性方程為:Y=289.380-869.151 X,r=0.999 0.慶大霉素的濃度劑量為1.0 u/ ml和0.5 u/ ml時(shí),吸收度約為0.3～0.6,選取這兩個(gè)濃度作為二劑量測(cè)定時(shí)的抗生素濃度,高低劑量比為2∶1.
2.3 回收率考察精密稱取慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品適量,用滅菌水制成1 000 u/ ml的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精密量取適量,用滅菌磷酸鹽緩沖液(pH7.8)分別稀釋制成濃度為1.0 u/ ml和0.5 u/ ml的標(biāo)準(zhǔn)品溶液;分別取相當(dāng)于標(biāo)示量的85%、100%、115%慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品,按硫酸慶大霉素顆粒處方中慶大霉素與輔料的比例分別加入相應(yīng)劑量的輔料,同法稀釋制成濃度為1.0 u/ ml和0.5 u/ ml的溶液。分別精密量取上述溶液1.0 ml,置滅菌比色管中,每種溶液各6管,照2.2所述方法測(cè)定�；厥章试�99.3%～101.1%之間,平均回收率100.3%,回收良好，結(jié)果見(jiàn)表1.表1 硫酸慶大霉素回收率試驗(yàn)結(jié)果醫(yī).學(xué).全.在.線m.zxtf.net.cn
2.4 重復(fù)性試驗(yàn)分別取相當(dāng)于標(biāo)示量85%、100%、115%慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品適量,按照硫酸慶大霉素處方中慶大霉素與輔料的比例分別加入相應(yīng)劑量的輔料,同法稀釋制成濃度為1.0 u/ ml和0.5 u/ ml的溶液,用二劑量法分別測(cè)定含量3次,其RSD分別為1.6%,1.0%和1.2%.
2.5 輔料的影響取空白輔料,按照硫酸慶大霉素顆粒中輔料的量配制不含主藥的空白溶液,照上述方法測(cè)定,其生長(zhǎng)曲線和陽(yáng)性對(duì)照完全一致,沒(méi)有抑菌作用,說(shuō)明空白輔料對(duì)實(shí)驗(yàn)無(wú)干擾。
2.6 濁度法和管碟法測(cè)定結(jié)果的比較取慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品及樣品適量,精密稱定,用滅菌水制成1 000 u/ ml的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,精密量取適量,用滅菌磷酸鹽緩沖液(pH7.8)分別稀釋制成濃度為1.0 u/ ml和0.5 u/ ml的溶液,高低劑量的劑間比為2:1.分別精密量取上述溶液1.0 ml,置滅菌比色管中,每種溶液各6管,分別加入含菌培養(yǎng)基9.0 ml,搖勻,密塞,放入CZB1抗生素光度測(cè)量?jī)x培養(yǎng)3～4 h.陰性對(duì)照:磷酸鹽緩沖液(pH7.8)1 ml,加9.0 ml未接種實(shí)驗(yàn)菌的培養(yǎng)基。分別用管碟法和濁度法的二劑量法對(duì)4批硫酸慶大霉素顆粒樣品進(jìn)行含量測(cè)定,對(duì)4批樣品用管碟法和濁度法測(cè)得的含量基本一致,可信限FL(%)濁度法更佳,兩種方法無(wú)顯著差異,結(jié)果見(jiàn)表2.表2 濁度法與管碟法測(cè)定硫酸慶大霉素結(jié)果比較
3 討論
3.1 試驗(yàn)菌液的制備和對(duì)試驗(yàn)的影響濁度法測(cè)定效價(jià)試驗(yàn)中,試驗(yàn)菌液的制備和質(zhì)量是影響實(shí)驗(yàn)的重要因素。制備試驗(yàn)用菌液有不同的方法[710],采用斜面接種試驗(yàn)菌后再用滅菌水洗下菌體制備菌液也可用于試驗(yàn),但是由于接種量難以控制,后期調(diào)整菌液濃度操作會(huì)更加繁瑣,而采用這種液體培養(yǎng)基培養(yǎng)菌液的方法更加簡(jiǎn)便,更容易控制菌液的濃度,同時(shí)解決了從斜面培養(yǎng)基上直接洗下菌體制成的菌懸液菌體不均勻的問(wèn)題。
