| 公開(公告)號 | CN100349918C |
| 公開(公告)日 | 2007.11.21 |
| 申請(專利)號 | CN03134442.9 |
| 申請日期 | 2003.07.30 |
| 專利名稱 | 呼吸道合胞病毒和腺病毒特異性免疫球蛋白制備方法 |
| 主分類號 | C07K16/10(2006.01)I |
| 分類號 | C07K16/10(2006.01)I;C07K16/18(2006.01)I;G01N33/569(2006.01)I;G01N33/68(2006.01)I |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權 | |
| 申請(專利權)人 | 廣東佰易藥業(yè)有限公司 |
| 發(fā)明(設計)人 | 張國成;許東亮;余 軍 |
| 地址 | 512026廣東省韶關市芙蓉東路112號 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進入國家日期 | |
| 專利代理機構 | 西安通大專利代理有限責任公司 |
| 代理人 | 李鄭建 |
| 國省代碼 | 廣東;44 |
| 主權項 | 抗呼吸道合胞病毒和腺病毒高效價特異性免疫球蛋白制備方法，其特征在于，包括以下步驟： 1)制備呼吸道合胞病毒腺病毒抗原 將呼吸道合胞病毒和腺病毒分別接種于已成長單層的Hep-2細胞或人胚腎細胞，37℃孵育，每天觀察細胞病變情況，當致細胞病變出現(xiàn)+++以上時或經(jīng)病毒抗原檢測陽性，收集細胞及上清，病毒滅活后經(jīng)超聲打碎、冰凍保存； 或按呼吸道合胞病毒和腺病毒的基因序列用基因工程方法表達制備保護性抗原； 按呼吸道合胞病毒和腺病毒的基因序列用基因工程方法表達制備保護性抗原的方法是，用低溫乙醇分離法或離子交換層析法方法或親和層析法篩選的含高效價特異性抗呼吸道合胞病毒和腺病毒免疫球蛋白的原料提取高效價特異性抗呼吸道合胞病毒和腺病毒免疫球蛋白，原料選自下組：人血漿、人血清、低溫乙醇分離法的含特異性抗呼吸道合胞病毒和腺病毒免疫球蛋白的中間產(chǎn)物； 2)純化病毒抗原 以蔗糖淀層濃縮或以不連續(xù)梯度密度離心純化病毒抗原，或層析吸附柱方法純化病毒抗原； 所述的蔗糖淀層濃縮或以不連續(xù)梯度密度離心純化病毒抗原的方法是：將超聲打碎的呼吸道合胞病毒和腺病毒抗原5000g離心20分鐘，棄去沉渣留上清，裝入以15％、30％、45％、60％的蔗糖制備的不連續(xù)梯度密度離心管，以165000g超速離心2小時，根據(jù)病毒的分子量確定該病毒所在離心管位置，吸出冰凍保存； 所述的層析吸附柱方法是：用離子交換層析法提取高效價特異性抗呼吸道合胞病毒和腺病毒免疫球蛋白時，原料經(jīng)DEAE-SepharoseCL-6B或DEAE-SepharoseFF柱，抗呼吸道合胞病毒和腺病毒免疫球蛋白流穿出柱；平衡條件為pH5.0～6.0，離子強度為0.01～0.03； 3)建立篩選高效價特異性抗呼吸道合胞病毒和腺病毒免疫球蛋白方法 用提取的呼吸道合胞病毒及腺病毒抗原10μg/ml～20μg/ml包被酶板，建立常規(guī)的ELISA方法或用病毒感染的細胞建立免疫熒光方法或用病毒抗原建立生物芯片方法，用以篩選正常人群獻血源中高效價特異性抗呼吸道合胞病毒和腺病毒免疫球蛋白；并用中和試驗方法確定高效價特異性免疫球蛋白的有效起始濃度，經(jīng)血源性傳染病原檢測合格后，將血源冰凍保存，以備免疫球蛋白的制備； 所述的免疫熒光法是，用呼吸道合胞病毒和腺病毒接種Hep-2細胞，當細胞出現(xiàn)病變后，刮下細胞，以PH7.2，0.01MPBS緩沖液洗3次，制備抗原片，經(jīng)冷丙酮固定后，冰凍保存，取待檢血清或血漿，經(jīng)稀釋后，加于抗原片孵育，經(jīng)洗滌后，加羊抗人熒光抗體，在熒光顯微鏡下觀察，正常Hep-2細胞抗原片做陰性對照，判定結果； 所述的生物芯片方法是：用微孔濾膜為載體，固化入呼吸道合胞病毒及腺病毒抗原，利用微孔濾膜的滲濾，濃縮，凝集作用，使待檢的獻血員血清或血漿與載體上的抗原進行快速反應，再與抗人IgG標記物直接在膜上反應顯色，反應后的芯片放入芯片閱讀系統(tǒng)，在專用的軟件的支持下，對不同點陣的灰度值進行分析，從而實現(xiàn)對呼吸道合胞病毒和腺病毒特異性IgG抗體的快速篩選； 4)篩選的呼吸道合胞病毒及腺病毒抗原用低溫乙醇分離方法或離子交換層析法方法或親和層析法提取高效價特異性抗呼吸道合胞病毒和腺病毒免疫球蛋白； 所述的低溫乙醇分離方法分離特異性抗呼吸道合胞病毒和腺病毒免疫球蛋白的乙醇濃度為15％～25％；pH為5.1～7.2；溫度為-3℃～-7℃；離出含特異性抗病毒免疫球蛋白的沉淀或上清，經(jīng)超濾濃縮脫醇，若提取的呼吸道合胞病毒及腺病毒抗原純度低于97％，用離子交換層析法提高純度，使用含DEAE-或S-基團的離子交換樹脂，直接吸附除特異性抗病毒免疫球蛋白之外的雜質，從而直接從流穿液獲得純化的抗病毒免疫球蛋白，其中條件為pH為5.0～6.8； 所述的離子交換樹脂選自下組：DEAE-Sepharose、DEAE-SepharoseFF、S-Sepharose、S-SepharoseFF和DEAE-SepHadxA-50所述的離子交換層析法流穿出柱的抗病毒免疫球蛋白再通過Lysine-Sepharose4B，將穿透液與洗滌液合并后，加入SP-SephadexC50或CM-SepharoseFF吸附，使用pH11的甘氨酸解析出特異性抗病毒免疫球蛋白；平衡條件為pH值6.0～5.4；解析條件為pH11的甘氨酸； 所述的親和層析法提取高效價特異性抗呼吸道合胞病毒和腺病毒免疫球蛋白時，對原料進行緩沖液處理后，通過親和層析柱，特異性抗病毒免疫球蛋白穿過親和層析柱，特異性抗病毒免疫球蛋白進行離子交換層析，從而獲得純化的特異性抗病毒免疫球蛋白； 親和層析的固體載體選自：Sephadex、PDX、Sephacryl、Sepharose、SepharoseCL、SepharoseFF、Superdex、Superose、Trisaceyl、Trisacylplus、UltrogelA、UltrogelAcA、高孔隙度的再生纖維素珠；緩沖液的鹽濃度為0.004～0.04，pH值為4.8～9.2； 5)提純后的抗呼吸道合胞病毒和腺病毒免疫球蛋白經(jīng)60±1℃，10小時滅活病毒和/或在pH值4.1±0.3，在24±1℃條件下放置21天滅活病毒，再經(jīng)除菌過濾，分裝成抗病毒免疫球蛋白。 |
| 摘要 | 本發(fā)明公開了一種有既可預防，又可治療、標本兼治的抗呼吸道合胞病毒和腺病毒高效價特異性免疫球蛋白的制備方法，首先用呼吸道合胞病毒或腺病毒經(jīng)Hep-2細胞或人胚腎細胞培養(yǎng)增殖，制備病毒抗原，或根據(jù)呼吸道合胞病毒和腺病毒基因序列用基因工程方法表達制備的保護性抗原。其次經(jīng)組織培養(yǎng)制備的病毒抗原，以不連續(xù)梯度密度離心純化抗原，或以20％蔗糖淀層濃縮抗原，或層析吸附柱方法純化抗原。然后用所制備的純化抗原，建立篩選高效價抗呼吸道合胞病毒和腺病毒免疫球蛋白的方法，及體外中和病毒試驗等。最后用低溫乙醇方法或離子交換層析法方法或親和層析法在具有高效價呼吸道合胞病毒和腺病毒免疫球蛋白血源中提取免疫球蛋白。 |
| 國際公布 |
