| 公開(公告)號 | CN101100678A |
| 公開(公告)日 | 2008.01.09 |
| 申請(專利)號 | CN200710023145.3 |
| 申請日期 | 2007.06.04 |
| 專利名稱 | 重組禽腺聯(lián)病毒載體介導(dǎo)的雞輸卵管生物反應(yīng)器制備方法 |
| 主分類號 | C12N15/861(2006.01)I |
| 分類號 | C12N15/861(2006.01)I;C12N15/12(2006.01)I |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(專利權(quán))人 | 揚(yáng)州大學(xué) |
| 發(fā)明(設(shè)計)人 | 孫懷昌;王安平;房浩霞;高 波;張鑫宇 |
| 地址 | 225009江蘇省揚(yáng)州市大學(xué)南路88號 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進(jìn)入國家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | 揚(yáng)州市錦江專利事務(wù)所 |
| 代理人 | 江 平 |
| 國省代碼 | 江蘇;32 |
| 主權(quán)項(xiàng) | 重組禽腺聯(lián)病毒載體介導(dǎo)的雞輸卵管生物反應(yīng)器制備方法，包括以下步驟： a、雞輸卵管特異表達(dá)載體pOV3K的改造：切除雞輸卵管特異表達(dá)人組織激肽釋放酶基因的載體pOV3K中的雞卵清蛋白o(hù)v基因的1568-2860位核苷酸區(qū)域，將其余片段回收，經(jīng)Klenow酶補(bǔ)平后連接，獲得由1.7kb ov5′調(diào)控區(qū)和牛生長激素基因polyA控制人組織激肽釋放酶基因表達(dá)的雞輸卵管特異表達(dá)載體pOV5K； b、含雞輸卵管特異表達(dá)控制元件和人組織激肽釋放酶基因的禽腺聯(lián)病毒轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建：先用限制酶Pml I將含禽腺聯(lián)病毒全基因組的質(zhì)粒pCR-AAAV線性化，電泳分離后回收，再用限制酶BsmB I消化，電泳分離后回收含禽腺聯(lián)病毒末端反向重復(fù)序列ITR的4.1Kb片段，用Klenow酶補(bǔ)平，獲得禽腺聯(lián)病毒轉(zhuǎn)移載體pAITR；根據(jù)pOV5K中ov5′調(diào)控區(qū)和牛生長激素基因PolyA序列設(shè)計一對引物： Forward：5-CTTGGCGCGCGCAGACTGACATGCATTTCATAGG-3 Reverse：5-TCGGGGTACCAGCGGAAGAGCGCCCAATACG-3 以pOV5K為模板，用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR擴(kuò)增人組織激肽釋放酶基因表達(dá)盒，與轉(zhuǎn)移載體pAITR連接，獲得含雞輸卵管特異表達(dá)控制元件和人組織激肽釋放酶的禽腺聯(lián)病毒轉(zhuǎn)移載體pAITR-OV5K； c、重組禽腺聯(lián)病毒的制備：根據(jù)禽腺聯(lián)病毒Rep基因5′端和Cap基因3′端序列設(shè)計引物，以pCR-AAAV為模板，用PCR擴(kuò)增Rep-Cap編碼區(qū)，插入pcDNA3.1/Zeo+載體后獲得禽腺聯(lián)病毒輔助質(zhì)粒pcDNA-ARC；將轉(zhuǎn)移載體pAITR-OV5K、輔助質(zhì)粒pcDNA-ARC、腺病毒輔助質(zhì)粒pHelper組成三質(zhì)粒系統(tǒng)，轉(zhuǎn)染AAV-293細(xì)胞，獲得雞輸卵管特異表達(dá)人組織激肽釋放酶基因的重組病毒； d、產(chǎn)蛋雞的重組病毒注射：用PBS緩沖液溶解純化和濃縮的重組病毒，并稀釋成2×1010病毒顆粒/毫升，翅靜脈注射產(chǎn)蛋雞，用免疫轉(zhuǎn)印和酶活性檢測法測定蛋清中目的蛋白的表達(dá)水平和組織特異性。 |
| 摘要 | 一種重組禽腺聯(lián)病毒載體介導(dǎo)的雞輸卵管生物反應(yīng)器制備方法，屬于基因工程和生物制藥領(lǐng)域。包括雞輸卵管特異表達(dá)調(diào)控元件的改造、含雞輸卵管特異表達(dá)調(diào)控元件和外源基因轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建、重組禽腺聯(lián)病毒的制備、產(chǎn)蛋雞的重組病毒注射。與現(xiàn)有的同類技術(shù)相比，該發(fā)明不僅具有非手術(shù)、簡單、實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)，而且目的基因的表達(dá)水平高、維持時間長、表達(dá)產(chǎn)物活性完全。表達(dá)在雞蛋清中的重組蛋白達(dá)到可純化水平，純化產(chǎn)物可作為防治人、畜疾病的藥物或疫苗。 |
| 國際公布 |
