免疫學(xué)和免疫學(xué)檢驗(yàn):第一節(jié)　T細(xì)胞表面標(biāo)志的檢測(cè)

一、特異性抗原的檢測(cè)

檢測(cè)人T細(xì)胞的特異性抗原，曾采用抗人腦、抗人胸腺細(xì)胞和抗人T細(xì)胞等抗血清，通過(guò)細(xì)胞毒試驗(yàn)或免疫熒光染色加以鑒定。自抗白細(xì)胞分化抗原的單克隆抗體問(wèn)世以來(lái)，上述諸多方法均被新方法取而代之。常用以鑒定和檢測(cè)計(jì)數(shù)T細(xì)胞的表面分化抗原如表21-1所示。

表21-1 T胞表面主要CD抗原及其特異性

用單克隆抗體檢測(cè)T細(xì)胞表面抗原的方法有兩大類，一類是用標(biāo)記抗體著染，如免疫熒光法、酶免疫法、生物素－親和素（或鏈霉親和素)系統(tǒng)的ABC法以及免疫金銀染色法；另一類是用抗體致敏的紅細(xì)胞作花環(huán)試驗(yàn)。兩類方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。以下敘述有代表性的方法。

（一)間接免疫熒光法

本法是將分離獲得的外周血單個(gè)核細(xì)胞分別與抗相應(yīng)CD的單克隆抗體（如CD2、CD4、CD8)結(jié)合后，洗去游離的抗體，繼加熒光素標(biāo)記的抗小鼠IgG抗血清，經(jīng)溫育結(jié)合后，洗去多余的標(biāo)記抗體，取樣制片，用熒光顯微鏡觀察并計(jì)數(shù)約200個(gè)單個(gè)核細(xì)胞，以熒光陽(yáng)性細(xì)胞與計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)之比，求得相應(yīng)CD抗原陽(yáng)性的T百分率。如有條件，細(xì)胞經(jīng)熒光標(biāo)記抗體著染后，用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)，快速而準(zhǔn)確，但需要較多的投資，難以普及應(yīng)用。

（二)免疫細(xì)胞化學(xué)法

通常用酶免疫檢測(cè)法，如APAAP酶免疫橋聯(lián)法。為減少非特異性著染，可選用生物素－鏈霉親和素系統(tǒng)試劑作ABC法染色。該類方法可用普通顯微鏡觀察，凡呈棕黃色的細(xì)胞為相應(yīng)CD抗原陽(yáng)性細(xì)胞，計(jì)其占總淋巴細(xì)胞的百分率。本法簡(jiǎn)便易行，不需特殊儀器，一般試驗(yàn)室均可采用。

（三)抗體致敏細(xì)胞花環(huán)法

用相應(yīng)的CD單克隆抗體致敏醛化的紅細(xì)胞作為指示物，它與受檢的細(xì)胞混勻后，置室溫片刻，繼經(jīng)低速離心，移放室溫作短期溫育或4℃過(guò)夜后，重懸取樣涂片染色鏡檢。凡受檢細(xì)胞周圍粘附有3個(gè)或更多紅細(xì)胞的判為花環(huán)形成細(xì)胞，共計(jì)數(shù)100～200個(gè)細(xì)胞，以花環(huán)形成數(shù)與計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)之比為相應(yīng)CD抗原陽(yáng)性細(xì)胞的百分率。本法需有相應(yīng)的致敏紅細(xì)胞試劑，受影響的因素較前兩法多。

二、特異性受體的檢測(cè)

T細(xì)胞表面有特異性綿羊紅細(xì)胞（E)受體和T細(xì)胞抗原識(shí)別受體（TCR)，其中E受體曾廣泛被用作鑒定和計(jì)數(shù)T細(xì)胞的標(biāo)志。當(dāng)人T細(xì)胞與綿羊紅細(xì)胞懸液按一定比例混勻后，置4℃至少2h或過(guò)夜，T細(xì)胞表面的E受體能與綿羊紅細(xì)胞結(jié)合而形成玫瑰花樣的花環(huán)（圖21-1)，取樣涂片染色、鏡檢計(jì)數(shù)可得總花環(huán)形成北，亦即T細(xì)胞的百分率。如減少淋巴細(xì)胞與綿羊紅細(xì)胞的比例，兩者混合后，經(jīng)短時(shí)間的溫育即行取樣涂片鏡檢計(jì)數(shù)，仍可見(jiàn)部分淋巴細(xì)胞形成花環(huán)，稱為活性E（Ea)花環(huán)，它可能代表T細(xì)胞的一個(gè)亞群，正常值僅為總E花環(huán)的1/3～1/2，約20％～40％。檢測(cè)Ea花環(huán)形成細(xì)胞比總E花環(huán)形成細(xì)胞更能反映受檢者的細(xì)胞免疫水平。這類花環(huán)試驗(yàn)多種多樣，因操作簡(jiǎn)便易行，曾被廣泛使用，但影響因素較多，操作稍有不同，所得結(jié)果差異較m.zxtf.net.cn/shouyi/大，因此漸被檢測(cè)CD抗原方法m.zxtf.net.cn/sanji/所取代。

圖21-1 顯微鏡下的E花環(huán)

有些哺乳動(dòng)物與人類相似，其外周血中T細(xì)胞能與某種或某幾種動(dòng)物的紅細(xì)胞結(jié)合形成花環(huán)，其匹配如牛、豬淋巴細(xì)胞與綿羊紅細(xì)胞，狗－人、貓－豚鼠、豚鼠－兔，因此這些相應(yīng)的花環(huán)試驗(yàn)可以作為實(shí)驗(yàn)研究細(xì)胞免疫有用的技術(shù)之一。T細(xì)胞抗在識(shí)別受體分α/βTCR和γ/δTCR，可用相應(yīng)單克隆抗體作免疫熒光檢測(cè)，現(xiàn)僅作為研究的工具。