生物化學與分子生物學:第三節(jié)　蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及其功能

蛋白質(zhì)為生物高分子物質(zhì)之一，具有三維空間結(jié)構(gòu)，因而執(zhí)行復雜的生物學功能。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能之間的關系非常密切。在研究中，一般將蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)分為一級結(jié)構(gòu)與空間結(jié)構(gòu)兩類。

一、蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)(primarystructure)就是蛋白質(zhì)多肽鏈中氨基酸殘基的排列順序(sequence)，也是蛋白質(zhì)最基本的結(jié)構(gòu)。它是由基因上遺傳密碼的排列順序所決定的。各種氨基酸按遺傳密碼的順序，通過肽鍵連接起來，成為多肽鏈，故肽鍵是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的主鍵。

迄今已有約一千種左右蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)被研究確定，如胰島素，胰核糖核酸酶、胰蛋白酶等。

蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)決定了蛋白質(zhì)的二級、三級等高級結(jié)構(gòu)，成百億的天然蛋白質(zhì)各有其特殊的生物學活性，決定每一種蛋白質(zhì)的生物學活性的結(jié)構(gòu)特點，首先在于其肽鏈的氨基酸序列，由于組成蛋白質(zhì)的20種氨基酸各具特殊的側(cè)鏈，側(cè)鏈基團的理化性質(zhì)和空間排布各不相同，當它們按照不同的序列關系組合時，就可形成多種多樣的空間結(jié)構(gòu)和不同生物學活性的蛋白質(zhì)分子。

圖1-1 胰島素的一級結(jié)構(gòu)

二、蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)分子的多肽鏈并非呈線形伸展，而是折疊和盤曲構(gòu)成特有的比較穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的生物學活性和理化性質(zhì)主要決定于空間結(jié)構(gòu)的完整，因此僅僅測定蛋白質(zhì)分子的氨基酸組成和它們的排列順序并不能完全了解蛋白質(zhì)分子的生物學活性和理化性質(zhì)。例如球狀蛋白質(zhì)(多見于血漿中的白蛋白、球蛋白、血紅蛋白和酶等)和纖維狀蛋白質(zhì)(角蛋白、膠原蛋白、肌凝蛋白、纖維蛋白等)，前者溶于水，后者不溶于水，顯而易見，此種性質(zhì)不能僅用蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)的氨基酸排列順序來解釋。

蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)就是指蛋白質(zhì)的二級、三級和四級結(jié)構(gòu)。

(一)蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)(secondarystructure)是指多肽鏈中主鏈原子的局部空間排布即構(gòu)象，不涉及側(cè)鏈部分的構(gòu)象。

1.肽鍵平面(或稱酰胺平面，amide plane)。

Pauling等人對一些簡單的肽及氨基酸的酰胺等進行了X線衍射分析，得出圖1-2所示結(jié)構(gòu)，從一個肽鍵的周圍來看，得知：

圖1-2 肽鍵平面示意圖

(1)

中的C-N鍵長0.132nm，比相鄰的N-C單鍵(0.147nm)短，而較一般C=N雙鍵(0.128nm)長，可見，肽鍵中-C-N-鍵的性質(zhì)介于單、雙鍵之間，具有部分雙鍵的性質(zhì)，因而不能旋轉(zhuǎn)，這就將固定在一個平面之內(nèi)。

(2)

　肽鍵的C及N周圍三個鍵角之和均為360°，說明都處于一個平面上，也就是說

六個原子基本上同處于一個平面，這就是肽鍵平面。肽鏈中能夠旋轉(zhuǎn)的只有α碳原子所形成的單鍵，此單鍵的旋轉(zhuǎn)決定兩個肽鍵平面的位置關系，于是肽鍵平面成為肽鏈盤曲折疊的基本單位。

(3)　肽鍵中的C-N既具有雙鍵性質(zhì)，就會有順反不同的立體異構(gòu)，已證實

處于反位(見圖1－3)。

圖1-3 反式肽單元和順式肽單元

2.蛋白質(zhì)主鏈構(gòu)象的結(jié)構(gòu)單元

1)α－螺旋Pauling等人對α－角蛋白(α－keratin)進行了X線衍射分析，從衍射圖中看到有0.5～0.55nm的重復單位，故推測蛋白質(zhì)分子中有重復性結(jié)構(gòu)，并認為這種重復性結(jié)構(gòu)為α－螺旋(α－h(huán)elix)見圖1-4。

圖1-4 蛋白質(zhì)分子的α－螺旋

α－螺旋的結(jié)構(gòu)特點如下：

(1)多個肽鍵平面通過α－碳原子旋轉(zhuǎn)，相互之間緊密盤曲成穩(wěn)固的右手螺旋。

(2)主鏈呈螺旋上升，每3.6個氨基酸殘基上升一圈，相當于0.54nm，這與X線衍射圖符合。

(3)相鄰兩圈螺旋之間借肽鍵中C＝O和H桸形成許多鏈內(nèi)氫健，即每一個氨基酸殘基中的NH和前面相隔三個殘基的C＝O之間形成氫鍵，這是穩(wěn)定α－螺旋的主要鍵。

(4)肽鏈中氨基酸側(cè)鏈R，分布在螺旋外側(cè)，其形狀、大小及電荷影響α－螺旋的形成。酸性或堿性氨基酸集中的區(qū)域，由于同電荷相斥，不利于α－螺旋形成；較大的R(如苯丙氨酸、色氨酸、異亮氨酸)集中的區(qū)域，也妨礙α－螺旋形成；脯氨酸因其α－碳原子位于五元環(huán)上，不易扭轉(zhuǎn)，加之它是亞氨基酸，不易形成氫鍵，故不易形成上述α－螺旋；甘氨酸的R基為H，空間占位很小，也會影響該處螺旋的穩(wěn)定。

2)β－片層結(jié)構(gòu)Astbury等人曾對β－角蛋白進行X線衍射分析，發(fā)現(xiàn)具有0.7nm的重復單位。如將毛發(fā)α－角蛋白在濕熱條件下拉伸，可拉長到原長二倍，這種α－螺旋的X線衍射圖可改變?yōu)榕cβ－角蛋白類似的衍射圖。說明β－角蛋白中的結(jié)構(gòu)和α－螺旋拉長伸展后結(jié)構(gòu)相同。兩段以上的這種折疊成鋸齒狀的肽鏈，通過氫鍵相連而平行成片層狀的結(jié)構(gòu)稱為β－片層(β－pleatedsheet)結(jié)構(gòu)或稱β－折迭(圖1－5)。

圖1-5 蛋白質(zhì)分子中的β－片層結(jié)構(gòu)

左：順向平行　右：逆向平行

β－片層結(jié)構(gòu)特點是：

①是肽鏈相當伸展的結(jié)構(gòu)，肽鏈平面之間折疊成鋸齒狀，相鄰肽鍵平面間呈110°角。氨基酸殘基的R側(cè)鏈伸出在鋸齒的上方或下方。

②依靠兩條肽鏈或一條肽鏈內(nèi)的兩段肽鏈間的C＝O與H梄形成氫鍵，使構(gòu)象穩(wěn)定。

③兩段肽鏈可以是平行的，也可以是反平行的。即前者兩條鏈從“N端”到“C端”是同方向的，后者是反方向的。β－片層結(jié)構(gòu)的形式十分多樣，正、反平行能相互交替。

④平行的β－片層結(jié)構(gòu)中，兩個殘基的間距為0.65nm；反平行的β－片層結(jié)構(gòu)，則間距為0.7nm。

3)β－轉(zhuǎn)角

蛋白質(zhì)分子中，肽鏈經(jīng)常會出現(xiàn)180°的回折，在這種回折角處的構(gòu)象就是β－轉(zhuǎn)角(β－turn或β－bend)。β－轉(zhuǎn)角中，第一個氨基酸殘基的C＝O與第四個殘基的N桯形成氫鍵，從而使結(jié)構(gòu)穩(wěn)定(圖1－6)。

圖1-6　蛋白質(zhì)分子中的β－轉(zhuǎn)角

4)無規(guī)卷曲

沒有確定規(guī)律性的部分肽鏈構(gòu)象，肽鏈中肽鍵平面不規(guī)則排列，屬于松散的無規(guī)卷曲(random coil)。

圖1-7 蛋白質(zhì)的超二級結(jié)構(gòu)示意

a.αα組合　b.βββ組合　c.βαβ組合

(二)超二級結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域

超二級結(jié)構(gòu)(supersecondarystructure)是指在多肽鏈內(nèi)順序上相互鄰近的二級結(jié)構(gòu)常常在空間折疊中靠近，彼此相互作用，形成規(guī)則的二級結(jié)構(gòu)聚集體。目前發(fā)現(xiàn)的超二級結(jié)構(gòu)有三種基本形式：α螺旋組合(αα)；β折疊組合(βββ)和α螺旋β折疊組合(βαβ)(圖1－7)，其中以βαβ組合最為常見。它們可直接作為三級結(jié)構(gòu)的“建筑塊”或結(jié)構(gòu)域的組成單位，是蛋白質(zhì)構(gòu)象中二級結(jié)構(gòu)與三級結(jié)構(gòu)之間的一個層次，故稱超二級結(jié)構(gòu)。

結(jié)構(gòu)域(domain)也是蛋白質(zhì)構(gòu)象中二級結(jié)構(gòu)與三級結(jié)構(gòu)之間的一個層次。在較大的蛋白質(zhì)分子中，由于多肽鏈上相鄰的超二級結(jié)構(gòu)緊密聯(lián)系，形成二個或多個在空間上可以明顯區(qū)別它與蛋白質(zhì)亞基結(jié)構(gòu)的區(qū)別。一般每個結(jié)構(gòu)域約由100-200個氨基酸殘基組成，各有獨特的空間構(gòu)象，并承擔不同的生物學功能。如免疫球蛋白(IgG)由12個結(jié)構(gòu)域組成，其中兩個輕鏈上各有2個，兩個重鏈上各有4個；補體結(jié)合部位與抗原結(jié)合部位處于不同的結(jié)構(gòu)域。一個蛋白質(zhì)分子中的幾個結(jié)構(gòu)域有的相同，有的不同；而不同蛋白質(zhì)分子之間肽鏈中的各結(jié)構(gòu)域也可以相同。如乳酸脫氫酶、3－磷酸甘油醛脫氫酶、蘋果酸脫氫酶等均屬以NAD+為輔酶的脫氫酶類，它們各自由2個不同的結(jié)構(gòu)域組成，但它們與NAD+結(jié)合的結(jié)構(gòu)域構(gòu)象則基本相同。

圖1-8　蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)中某些次級鍵

(三)蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)的多肽鏈在各種二級結(jié)構(gòu)的基礎上再進一步盤曲或折迭形成具有一定規(guī)律的三維空間結(jié)構(gòu)，稱為蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)(tertiary structure)。蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定主要靠次級鍵，包括氫鍵、疏水鍵、鹽鍵以及范德華力(Van der Wasls力)等(圖1-8)。這些次級鍵可存在于一級結(jié)構(gòu)序號相隔很遠的氨基酸殘基的R基團之間，因此蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)主要指氨基酸殘基的側(cè)鏈間的結(jié)合。次級鍵都是非共價鍵，易受環(huán)境中pH、溫度、離子強度等的影響，有變動的可能性。二硫鍵不屬于次級鍵，但在某些肽鏈中能使遠隔的二個肽段聯(lián)系在一起，這對于蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定上起著重要作用。

現(xiàn)也有認為蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)是指蛋白質(zhì)分子主鏈折疊盤曲形成構(gòu)象的基礎上，分子中的各個側(cè)鏈所形成一定的構(gòu)象。側(cè)鏈構(gòu)象主要是形成微區(qū)(或稱結(jié)構(gòu)域domain)。對球狀蛋白質(zhì)來說，形成疏水區(qū)和親水區(qū)。親水區(qū)多在蛋白質(zhì)分子表面，由很多親水側(cè)鏈組成。疏水區(qū)多在分子內(nèi)部，由疏水側(cè)鏈集中構(gòu)成，疏水區(qū)常形成一些“洞穴”或“口袋”，某些輔基就鑲嵌其中，成為活性部位。

具備三級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)從其外形上看，有的細長(長軸比短軸大10倍以上)，屬于纖維狀蛋白質(zhì)(fibrous protein)，如絲心蛋白；有的長短軸相差不多基本上呈球形，屬于球狀蛋白質(zhì)(globular protein)，如血漿清蛋白、球蛋白、肌紅蛋白，球狀蛋白的疏水基多聚集在分子的內(nèi)部，而親水基則多分布在分子表面，因而球狀蛋白質(zhì)是親水的，更重要的是，多肽鏈經(jīng)過如此盤曲后，可形成某些發(fā)揮生物學功能的特定區(qū)域，例如酶的活性中心等。

(四)蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)

具有二條或二條以上獨立三級結(jié)構(gòu)的多肽鏈組成的蛋白質(zhì)，其多肽鏈間通過次級鍵相互組合而形成的空間結(jié)構(gòu)稱為蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)(quarternary structure)。其中，每個具有獨立三級結(jié)構(gòu)的多肽鏈單位稱為亞基(subunit)。四級結(jié)構(gòu)實際上是指亞基的立體排布、相互作用及接觸部位的布局。亞基之間不含共價鍵，亞基間次級鍵的結(jié)合比二、三級結(jié)構(gòu)疏松，因此在一定的條件下，四級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)可分離為其組成的亞基，而亞基本身構(gòu)象仍可不變。

一種蛋白質(zhì)中，亞基結(jié)構(gòu)可以相同，也可不同。如煙草斑紋病毒的外殼蛋白是由2200個相同的亞基形成的多聚體；正常人血紅蛋白A是兩個α亞基與兩個β亞基形成的四聚體；天冬氨酸氨甲�；�轉(zhuǎn)移酶由六個調(diào)節(jié)亞基與六個催化亞基組成。有人將具有全套不同亞基的最小單位稱為原聚體(protomer)，如一個催化亞基與一個調(diào)節(jié)亞基結(jié)合成天冬氨酸氨甲�；�轉(zhuǎn)移酶的原聚體。

某些蛋白質(zhì)分子可進一步聚合成聚合體(polymer)。聚合體中的重復單位稱為單體(monomer)，聚合體可按其中所含單體的數(shù)量不同而分為二聚體、三聚體……寡聚體(oligomer)和多聚體(polymer)而存在，如胰島素(insulin)在體內(nèi)可形成二聚體及六聚體。

圖1－9　肌紅蛋白的三級結(jié)構(gòu)和丙糖磷酸異構(gòu)酶的三級結(jié)構(gòu)圖

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圖1-10　面紅蛋白亞基結(jié)合模式圖

三、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的關系

(一)蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)與其構(gòu)象及功能的關系

蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)是空間結(jié)構(gòu)的基礎，特定的空間構(gòu)象主要是由蛋白質(zhì)分子中肽鏈和側(cè)鏈R基團形成的次級鍵來維持，在生物體內(nèi)，蛋白質(zhì)的多肽鏈一旦被合成后，即可根據(jù)一級結(jié)構(gòu)的特點自然折疊和盤曲，形成一定的空間構(gòu)象。

Anfinsen以一條肽鏈的蛋白質(zhì)核糖核酸酶為對象，研究二硫鍵的還原和氧化問題，發(fā)現(xiàn)該酶的124個氨基酸殘基構(gòu)成的多肽鏈中存在四對二硫鍵，在大量β－巰基乙醇和適量尿素作用下，四對二硫鍵全部被還原為桽H，酶活力也全部喪失，但是如將尿素和β－巰基乙醇除去，并在有氧條件下使巰基緩慢氧化成二硫鍵，此時酶的活力水平可接近于天然的酶。Anfinsen在此基礎上認為蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)決定了它的二級、三級結(jié)構(gòu)，即由一級結(jié)構(gòu)可以自動地發(fā)展到二、三級結(jié)構(gòu)(圖1-10)。

一級結(jié)構(gòu)相似的蛋白質(zhì)，其基本構(gòu)象及功能也相似，例如，不同種屬的生物體分離出來的同一功能的蛋白質(zhì)，其一級結(jié)構(gòu)只有極少的差別，而且在系統(tǒng)發(fā)生上進化位置相距愈近的差異愈小(表1-2，表1－3)。

表1-2　胰島素分子中氨基酸殘基的差異部分

表1-3　細胞色素C分子中氨基酸殘基的差異數(shù)目及分歧時間

圖1-11　核糖核酸酶的變性和復性示意圖

(A)天然核糖核酸酶(B)變性失活(C)“錯亂”核糖核酸酶

促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)和促黑激素(MSH)均為垂體分泌的多肽激素。α－MSH和ACTh 4～10位的氨基酸結(jié)構(gòu)與β－MSH的11～17位一樣，故ACTH有較弱的MSH的生理作用(圖1-12)。

在蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)中，參與功能活性部位的殘基或處于特定構(gòu)象關鍵部位的殘基，即使在整個分子中發(fā)生一個殘基的異常，那么該蛋白質(zhì)的功能也會受到明顯的影響。被稱之為“分子病”的鐮刀狀紅細胞性貧血僅僅是574個氨基酸殘基中，一個氨基酸殘基即β亞基N端的第6號氨基酸殘基發(fā)生了變異所造成的，這種變異來源于基因上遺傳信息的突變(如圖1-13)。

圖1-12　ACTH、α-MSH和β-MSH一級結(jié)構(gòu)比較

圖1-13　鐮刀狀紅細胞性貧血血紅蛋白遺傳信息的異常

(二)蛋白質(zhì)空間橡象與功能活性的關系

蛋白質(zhì)多種多樣的功能與各種蛋白質(zhì)特定的空間構(gòu)象密切相關，蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象是其功能活性的基礎，構(gòu)象發(fā)生變化，其功能活性也隨之改變。蛋白質(zhì)變性時，由于其空間構(gòu)象被破壞，故引起功能活性喪失，變性蛋白質(zhì)在復性后，構(gòu)象復原，活性即能恢復。

在生物體內(nèi)，當某種物質(zhì)特異地與蛋白質(zhì)分子的某個部位結(jié)合，觸發(fā)該蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生一定變化，從而導致其功能活性的變化，這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的別構(gòu)效應(allostery)。

蛋白質(zhì)(或酶)的別構(gòu)效應，在生物體內(nèi)普遍存在，這對物質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)和某些生理功能的變化都是十分重要的。

現(xiàn)以血紅蛋白(hemoglobin,簡寫Hb)為例來說明構(gòu)象與功能的關系。

血紅蛋白是紅細胞中所含有的一種結(jié)合蛋白質(zhì)，它的蛋白質(zhì)部分稱為珠蛋白(globin)，非蛋白質(zhì)部分(輔基)稱為血紅素(見圖1-14)。Hb分子由四個亞基構(gòu)成，每一亞基結(jié)合一分子血紅素。正常成人Hb分子的四個亞基為兩條α鏈，兩條β鏈。α鏈由141個氨基酸殘基組成，β鏈由146個氨基酸殘基組成，它們的一級結(jié)構(gòu)均已確定。每一亞基都具有獨立的三級結(jié)構(gòu)，各肽鏈折疊盤曲成一定構(gòu)象，β亞基中有8個α－螺旋區(qū)(分別稱A、B……H螺旋區(qū))，α亞基中有7個α－螺旋區(qū)。在此基礎上肽鏈進一步折疊形成球狀，依賴側(cè)鏈間形成的各種次級鍵維持穩(wěn)定，使之球形表面為親水區(qū)，球形向內(nèi)，在E和F螺旋段間的20多個巰水氨基酸側(cè)鏈構(gòu)成口袋形的疏水區(qū)，輔基血紅素www.med126.com就嵌接在其中，α亞基和β亞基構(gòu)象相似，最后，四個亞基α2β2聚合成具有四級結(jié)構(gòu)的Hb分子(見圖1-15)。在此分子中，四個亞基沿中央軸排布四方，兩α亞基沿不同方向嵌入兩個β亞基間，各亞基間依多種次級健聯(lián)系，使整個分子呈球形，這些次級鍵對于維系Hb分子空間構(gòu)象有重要作用，例如在四亞基間的8對鹽鍵(圖1-16)，它們的形成和斷裂將使整個分子的空間構(gòu)象發(fā)生變化。

圖1-14 血紅素的結(jié)構(gòu)式

圖1-15　血紅蛋白β亞基的構(gòu)象

ABCDEFGH分別代表不同的α－螺旋區(qū)。共有八個螺旋區(qū)；阿拉伯數(shù)字代表在該區(qū)氨基酸殘基的序號；a-螺旋區(qū)之間的移行部位為無規(guī)卷曲，用AB，CD，EF，F(xiàn)G…等表示。C1，E7，C5，CF，C3，E3，的中間為血紅素，其中較大的黑點代表Fe2+。

圖1-16 血紅蛋白亞基間鹽鍵示意圖

圖1-7　鐵原子在氧合時落入血紅素平面

圖1-18

圖1-19　Hb的氧飽和曲線

Hb在體內(nèi)的主要功能為運輸氧氣，而Hb的別位效應，極有利于它在肺部與O2結(jié)合及在周圍組織釋放O2。

Hb是通過其輔基血紅素的Fe++與氧發(fā)生可逆結(jié)合的，血紅素的鐵原子共有6個配位鍵，其中4個與血紅素的吡咯環(huán)的N結(jié)合，一個與珠蛋白亞基F螺旋區(qū)的第8位組氨酸(F8)殘基的咪唑基的N相連接，空著的一個配位鍵可與O2可逆地結(jié)合，結(jié)合物稱氧合血紅蛋白。

在血紅素中，四個吡咯環(huán)形成一個平面，在未與氧結(jié)合時Fe++的位置高于平面0.7Å，一旦O2進入某一個α亞基的疏水“口袋”時，與Fe++的結(jié)合會使Fe++嵌入四吡咯平面中，也即向該平面內(nèi)移動約0.75Å(圖1-17)，鐵的位置的這一微小移動，牽動F8組氨酸殘基連同F(xiàn)螺旋段的位移，再波及附近肽段構(gòu)象，造成兩個α亞基間鹽鍵斷裂，使亞基間結(jié)合變松，并促進第二亞基的變構(gòu)并氧合，后者又促進第三亞基的氧合(圖1-18)使Hb分子中第四亞基的氧合速度為第一亞基開始氧合時速度的數(shù)百倍。此種一個亞基的別構(gòu)作用，促進另一亞基變構(gòu)的現(xiàn)象，稱為亞基間的協(xié)同效應(cooperativity)，所以在不同氧分壓下，Hb氧飽和曲線呈“S”型(圖1-19)。