基因治療

　（三)靶細(xì)胞的選擇

　　理論上講，無論何種細(xì)胞均具有接受外源DNA的能力，目前基因治療中禁止使用生殖細(xì)胞作為靶細(xì)胞，而只能使用體細(xì)胞，用于轉(zhuǎn)基因的體細(xì)胞必須取材方便，含量豐富，容易培養(yǎng)，壽命較長(zhǎng)�？蛇x擇的細(xì)胞有淋巴細(xì)胞、造血細(xì)胞、上皮細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞、肌肉細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞等。在實(shí)際上應(yīng)用中應(yīng)具體根據(jù)目的條件選擇。

　�。ㄋ�)細(xì)胞轉(zhuǎn)染（tansfection)

　　將目的基因?qū)�入靶�?xì)胞的方法很多，大致可分為物理學(xué)方法、化學(xué)方法、融合法和病毒感染法四類。病毒法已在本節(jié)的“基因的轉(zhuǎn)運(yùn)”中有基因介紹。目前較多使用的是脂質(zhì)體法。

表23-3 DNA導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞常見的方法

　　在目前的技術(shù)狀態(tài)下，一般而言其基因轉(zhuǎn)染效率很難達(dá)到100%。故必須首先將轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞和未轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞加以區(qū)分。這方面的新技術(shù)發(fā)展很快，常用的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞篩選方法有：

　　利用基因表達(dá)產(chǎn)物篩選法：（1)標(biāo)記基因篩選法：在載體上引入一個(gè)標(biāo)記基因，或同時(shí)導(dǎo)入標(biāo)記基因，在轉(zhuǎn)染后的適當(dāng)時(shí)間選用合適劑量的選擇培養(yǎng)基，篩選標(biāo)記基因表型，那些已導(dǎo)入外源基因的細(xì)胞將存活下來，而未轉(zhuǎn)錄的細(xì)胞則死于選擇性細(xì)胞培養(yǎng)基。如在較多的載體中都有neor標(biāo)記基因存在，若向培養(yǎng)基中加入G418進(jìn)行選擇，最后只有轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞存活下來。（2)基因缺陷型受體細(xì)胞的選擇性：以基因缺陷型細(xì)胞作為靶細(xì)胞，將正常基因?qū)�入基因缺陷型靶�?xì)胞后，使用選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。例如將TK基因?qū)�入TK-的靶細(xì)胞，轉(zhuǎn)錄細(xì)胞可在HAT培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，未轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞則不能在HAT培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。（3)基因共轉(zhuǎn)染技術(shù)：將目的基因表達(dá)載體DNA和標(biāo)記基因表達(dá)載體DNA混合后共同轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞中，分別使用標(biāo)記基因和目的基因?qū)��?yīng)的選擇劑進(jìn)行兩次篩選，最后得到復(fù)合轉(zhuǎn)導(dǎo)的轉(zhuǎn)化子。

　　分子生物學(xué)方法：外源基因是否真的轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞必須用分子雜交方法進(jìn)行證實(shí)。常用的方法有原位雜效，Southern雜交和打點(diǎn)雜交。其中主要問題是探針的選擇。若靶細(xì)胞內(nèi)原來不存在所轉(zhuǎn)入的目的基因，可選用目的基因作為探針；靶細(xì)胞內(nèi)一般無標(biāo)記基因存在，故標(biāo)記基因是良好的探針。探針大小可以是較大的DNA片段，亦可是人工合成的DNA單鏈探針分子。PCR方法目前也已用于轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的鑒定，且該法相對(duì)簡(jiǎn)單易行。

　�。ㄎ�)外源基因的表達(dá)及檢測(cè)

　　在篩選出轉(zhuǎn)化分子后還需要鑒定轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中外源基因的表達(dá)狀況。其中包括對(duì)目的基因和標(biāo)記基因表達(dá)的鑒定。常用方法有原位雜交，Northrn雜交，NRA打點(diǎn)雜交，免疫組織化學(xué)染色等，前幾項(xiàng)是檢測(cè)外源基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA，后者則是檢測(cè)外源基因翻譯出的蛋白質(zhì)。流式細(xì)胞儀是一種較為客觀準(zhǔn)確的儀器，可定量分析外源基因的表達(dá)狀況。

　　一些影響基因表達(dá)的因素如表4所示。

表23-4 調(diào)節(jié)重組細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的DNA控制元件

　　三、基因治病的靶向

　　基因治療中的靶向問題是基因治療中急待解決的問題。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是目前治療中應(yīng)用較為廣泛且效果較好的載體。有關(guān)逆轉(zhuǎn)錄病毒靶向的研究已取得一些進(jìn)展，使得基因治療更為安全和有效。

　�。ㄒ�)逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞類型的選擇調(diào)節(jié)

　　Mo-HLV是一個(gè)可廣泛轉(zhuǎn)導(dǎo)多種細(xì)胞的病毒，為了使其僅感染某些專一性細(xì)胞就必須改變其感染譜。

　　1、改變Mo-HLV感染譜

　　按宿主范圍可將Mo-HLV分為三類：?jiǎn)蜗蛐裕褐荒芨腥緡�齒類細(xì)胞；異向性：可感染除嚙齒類動(dòng)物細(xì)胞以外的其它的細(xì)胞；雙向性：可感染人及嚙齒類動(dòng)物等大多數(shù)細(xì)胞。感染細(xì)胞的類型是由病毒的外殼蛋白env確定的。

　　（1)病毒與抗體的偶聯(lián)：為了使逆轉(zhuǎn)錄病毒定向感染所需要的靶細(xì)胞，可將病毒與抗體偶聯(lián)，該抗體則針對(duì)所需感染細(xì)胞上特有的抗原。如使單向感染病毒與抗人MHC-1。MHC-II的抗體偶聯(lián)或與抗人表皮生長(zhǎng)因子的抗體偶聯(lián)后，可以感染人類細(xì)胞。Goud等使用此法使單向病毒感染人的肝細(xì)胞，可惜病毒未能整合入肝細(xì)胞基因組，可能其中還有其它原因。

　　（2)病毒外殼蛋白與配體偶聯(lián)：　如將env蛋白與乳糖偶聯(lián)成去延酸糖蛋白，用此法改造的單向逆轉(zhuǎn)錄病毒將不再感染原先的宿主而只感染人的肝細(xì)胞，因?yàn)橹挥懈渭?xì)胞表面上含有去延酸糖蛋白的受體。

　�。�3)改變病毒外殼蛋白的識(shí)別序列：已發(fā)現(xiàn)env蛋白與被感染細(xì)胞受體相識(shí)別部位的化學(xué)組成，如果改變核表位的基因序列，就可能改變感染細(xì)胞的類型，但Etienne等認(rèn)為有一個(gè)潛在的、非病毒原有的表位與細(xì)胞受體識(shí)別之后不能使病毒內(nèi)化。一種可行的方法是同時(shí)表達(dá)原有的env蛋白，就能解決內(nèi)化問題。

　　2、使用其它逆轉(zhuǎn)錄病毒載體：

　　牛白血病逆轉(zhuǎn)錄病毒，猿免疫缺陷病毒，鼠乳腺腫瘤病毒有組織專一性感染的特點(diǎn)，有些研究組利用其作為載體。Page等采用HIV作為病毒載體，Rizvi等用BLV作載體，Morris等采用MMTV作載體，并構(gòu)建了MMTV獨(dú)特的包裝細(xì)胞，使病毒滴度提高百倍以上，但同Mo-MLV相比，其它病毒的滴度偏低。

　　3、以嵌合逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體

　　逆轉(zhuǎn)錄病毒感染譜是由病毒顆粒決定的，如果我們改變病毒顆粒蛋白，即保留毒gagpol基因，而env基因來自另一個(gè)逆轉(zhuǎn)錄病毒，即可改變感染宿主范圍。Laudau等用鳥逆轉(zhuǎn)錄病毒和RSV的env基因取代Mo-MLVR env基因，Miller等用長(zhǎng)臂猿白血病病毒的env基因嵌合Mo-MLVR成功感染了多種細(xì)胞，并取得較高的滴度，Gong等用流感病毒的血凝素取代RSV的env基因蛋白，將血凝素成功地嵌入病毒外殼，并能有效感染人和鳥類細(xì)胞。Jane等用泡狀口炎病毒G糖蛋白取代莫洛尼病毒env蛋白，使該病毒顆粒能成功地感染非哺乳動(dòng)物如Zebra fish細(xì)胞，更重要的是這種病毒外殼可耐受超離心而不影響感染效率，因此有利于濃縮病毒，提高滴度。

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