免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)為在細(xì)胞水平上研究免疫反應(yīng)做出了貢獻(xiàn)，但由于光學(xué)分辨率的限制，不可能從細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)水平觀察和研究免疫反應(yīng)。因此，Singer于1959年首先提出用電子密度較高的物質(zhì)鐵蛋白（ferritin)標(biāo)記抗體的方法，為在細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)水平研究抗原抗體反應(yīng)提供了可能。在此基礎(chǔ)上，相繼發(fā)展了雜交抗體技術(shù)、鐵蛋白抗鐵蛋白復(fù)合物技術(shù)、蛋白A-鐵蛋白標(biāo)記技術(shù)、免疫酶技術(shù)及膠體金技術(shù)等。電子顯微鏡免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)（以下簡稱免疫電鏡技術(shù)技術(shù))區(qū)別于免疫細(xì)胞化學(xué)和常規(guī)電鏡技術(shù)主要在以下幾方面：
一、組織固定與取材
在這方面的要求是即要保存良好的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，又要注意保持組織的抗原性。因此，選用固定劑不宜過強(qiáng)。常用的免疫電鏡固定劑有多聚甲醛—戊二醛混合液和過碘酸-賴氨酸—多聚甲醛液（Periodate—Lysine –Paraformaldehyde簡稱PLP液)。也有采用Bouin氏液、Zamboni氏液或4%多聚甲醛液（其配制法見附錄)。國外不少文獻(xiàn)推薦應(yīng)用PLP液于免疫電鏡技術(shù)，認(rèn)為該固定液對含糖類豐富的組織固定效果特佳，因為組織抗原絕大多數(shù)由蛋白質(zhì)和糖兩部分組成，抗原決定簇位于蛋白部分，有選擇性地使糖類固定，就可使抗原性穩(wěn)定。PLP液中過碘酸能氧化糖類，使其產(chǎn)生醛基，再經(jīng)賴氨酸作用，使新形成的醛基分子間和分子內(nèi)相互連接，穩(wěn)定組織抗原。但賴氨酸價格較貴，不如多聚甲醛戊二醛固定液經(jīng)濟(jì)、簡便、效果佳。在取材方面，免疫電鏡技術(shù)較光鏡免疫化學(xué)技術(shù)要求更迅速、精細(xì)。
二、免疫染色
分為包埋前染色、包埋后染色和超薄切片免疫染色三種。
1．包埋前染色 即先行免疫染色，在解剖顯微鏡下將免疫反應(yīng)陽性部位取出，修整成小塊，按常規(guī)電鏡方法處理，經(jīng)鋨酸固定、脫水、包埋。如果特異性免疫反應(yīng)的范圍太小，為了準(zhǔn)確定位，可作第二次包埋，即第一次包埋時將組織置于兩層thermanox塑料片之間，中夾環(huán)氧樹脂如夾心面包式，進(jìn)行高溫聚合，然后在解剖顯微鏡下取出需要部位作第二次包埋。包埋前染色的組織，以中層較為理想。表層因受機(jī)械修整，結(jié)構(gòu)往往保存不好，深層因抗體不能透入，免疫反應(yīng)弱或無。在作超薄切片前應(yīng)先切半薄切片，尋出免疫反應(yīng)陽性部位。根據(jù)作者經(jīng)驗，半薄切片可在相差顯微鏡下不染色進(jìn)行觀察（指PAP染色法)，免疫反應(yīng)部位呈黑點狀。在HE或甲苯胺藍(lán)染色的半薄切片上，免疫反應(yīng)部位呈棕黃色。據(jù)此定位作超薄切片，可大大提高陽性反應(yīng)檢出率。為避免電鏡鉛、鈾染色反應(yīng)與免疫反應(yīng)之間的混淆，可取相連續(xù)的起薄切片，分別以兩個銅網(wǎng)撈取，其中之一進(jìn)行染色觀察，另一以鈾單染色或不染色進(jìn)行對照觀察。
包埋前染色法的優(yōu)點是：①切片染色前不經(jīng)過鋨酸后固定、脫水及樹脂包埋等過程，抗原未被破壞，易于獲得良好的免疫反應(yīng)。②可在免疫反應(yīng)陽性部位定位作超薄切片，提高電鏡下的檢出率。特別適用于含抗原量較少的組織，但由于經(jīng)過一系列的免疫染色步驟，常出現(xiàn)一定的超微結(jié)構(gòu)損傷。
2．包埋后染色 組織標(biāo)本經(jīng)過固定、脫水及樹脂包埋、制成超薄切片后，再進(jìn)行免疫組化染色。由于是以貼在網(wǎng)上的超薄切片進(jìn)行免疫染色，故又名之載網(wǎng)染色（on grid staining)。必須指出的是：①后固定中是否應(yīng)用四氧化鋨存在不同意見，作者經(jīng)驗一般以不用四氧化鋨為佳，或盡量縮短在四氧化鋨中停留的時間。有作者認(rèn)為，從理論上講，四氧化鋨具有保存抗原的作用，但實踐證明應(yīng)用四氧化鋨可使抗原活性明顯減低。②在載網(wǎng)染色過程中，銅網(wǎng)易與化學(xué)物質(zhì)產(chǎn)生反應(yīng)，故需選用鎳網(wǎng)或金網(wǎng)。③在免疫組化處理的全過程中，應(yīng)注意保持網(wǎng)面的濕潤，網(wǎng)面干燥會影響抗體活性。本法的優(yōu)點是超微結(jié)構(gòu)保存較好，方法簡便，陽性結(jié)構(gòu)有高度的可重復(fù)性，還能在同一張切片上進(jìn)行多重免疫染色。但抗原活性在電鏡生物樣品處理過程中可能減弱甚至喪失；環(huán)氧樹脂中的環(huán)氧基，在聚合過程中可能與組織成份發(fā)生反應(yīng)而改變抗原性質(zhì)；包埋在環(huán)氧樹脂中的環(huán)氧基，在聚合過程中可能與組織成份發(fā)生反應(yīng)而改變抗原性質(zhì)；包埋在環(huán)氧樹脂中的組織不易進(jìn)行免疫反應(yīng)等。因此，免疫組化工作者曾試圖以不同的方法如飽和苯溶液，無水酒精中NaOH飽和溶液或乙氧化鈉溶液等以減少或去除包埋劑，取得不同程度的效果�，F(xiàn)普遍采用的是在進(jìn)行免疫染色前，以H2O2液蝕刻數(shù)分鐘，以去鋨和增強(qiáng)樹脂的穿透性。醫(yī)學(xué)全在線網(wǎng)站www.med126.com
3．超薄冰凍切片 按照Tokuyasu建立的方法，將組織置于2.3mol/L蔗糖液中，以液氮速凍，在冰凍超薄切片機(jī)上切片，切片厚度可略厚于常規(guī)樹脂切片。冰凍超薄切片由于不需經(jīng)固定、脫水、包埋等步驟，直接進(jìn)行免疫染色，所以抗原性保存較好，兼有包埋前和包埋后染色的優(yōu)點。
三、包埋
�。ㄒ�)樹脂包埋
國內(nèi)現(xiàn)普遍采用的是環(huán)氧樹脂包埋法，可直接脫水后包埋，也可將小片組織或半薄切片貼在載片上，將充滿環(huán)氧樹脂的明膠囊倒置于切片上聚合、硬化，進(jìn)行原位包埋。
�。ǘ�)低溫包埋
常規(guī)樹脂包埋由于需高溫聚合等處理程序，組織抗原性可能全部或部分丟失。因此，在免疫電鏡技術(shù)方面，國外不少實驗室已開始采用低溫技術(shù)如低溫包埋和冰凍超薄切片等，后者需配備冰凍超薄切片機(jī)，且技術(shù)難度較大，不如低溫包埋法易推廣。低溫包埋劑的研究開始于60年代，80年代免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)在電鏡水平上的廣泛的應(yīng)用，為低溫包埋劑的實驗研究開辟了廣闊的領(lǐng)域。國內(nèi)已有較多的應(yīng)用報道，國內(nèi)一些實驗室已開始摸索。作為低溫包埋劑的多為乙烯系化合物如乙二醇甲基丙烯酸酯（Glycolmethacrylate,GMA),Lowicryls, LR White和Lr Gold等，目前國外生產(chǎn)廠家有Polysciences INC , Reichert—Jung 和LKB等系列產(chǎn)品。現(xiàn)將常用的幾種低溫包埋劑及其應(yīng)用簡單介紹如下：
1．Lowicryls 是丙烯酸鹽（acrylate) 和甲基丙烯酸鹽（methacrylate)化學(xué)物質(zhì)，包括K4M、HM20、K11M、KM23等系列產(chǎn)品（Polysciences INC)，其特點是能在低溫下保持低粘度（K4M：--35℃；HM20：-70℃；K11M、HM23：-60℃～-80℃)和具有在光照射（紫外光，波長360nm)下聚合的能力，它的光聚合作用與溫度無度。其中K4M和K11M具有親水性，特別適合于免疫細(xì)胞化學(xué)的應(yīng)用，因它能較好地保持組織結(jié)構(gòu)和抗原性，減少背景染色。HM20和HM23具疏水性，能產(chǎn)生高反差圖像，適用于掃描、透射電鏡和暗視野觀察切片的制作。所有這些種類的低溫包埋劑都適用于冰凍置換技術(shù)。K4M的應(yīng)用和報道較多，現(xiàn)側(cè)重介紹如下：
�。�1)包埋劑的配制：商品提供的Lowicrys包埋劑由三個部分組成：單體（Monomer)，交聯(lián)劑（Crosslinker)和引發(fā)劑（Initator)。調(diào)整單體和交聯(lián)劑的比例，增加交聯(lián)劑的量，組織塊的硬度增加。中等硬度的組織塊，其配制比例如下：
K4M：單體 17.30g
交聯(lián)劑 2.70g
引發(fā)劑 0.10g
K11M：單體 19.00g
交聯(lián)劑 1.00g
引發(fā)劑 0.10g
作者的經(jīng)驗，可用微量注射器加針頭抽取后，注入棕色的玻璃容器避光，用玻棒輕攪3～5min或用一小管通入液氮氣泡以攪拌之。勿過分?jǐn)嚢�，以防氧的氣泡進(jìn)入包埋劑中。
（2)生物樣品處理程序（Lemanski 等1985)
�、賱游锫樽砣〔�，以多聚甲醛—賴氨酸—過碘酸鈉在9℃固定2h。
②磷酸緩沖液含7%蔗糖，pH7.2,沖洗過夜，0℃
�、�0.1mol/L 磷酸緩沖液，pH7.2,沖洗，0℃
�、苊撍�65%乙醇，1h ,0℃
80%乙醇，2h,-35℃
Lowicryl K4M：80%乙醇=1：11h -35℃
Lowicryl K4M：80%乙醇=2：11h -35℃
100% Lowicryl K4M 1h -35℃
100% Lowicryl K4M 過夜-35℃
�、莅瘢盒迈rK4M置于膠囊內(nèi)，將組織移入，在-30℃～-40℃以紫外線燈波長360nm 2× 15W（Ladd Research Industries Burlington VT)相距30～40cm照射24h使之聚合。如為100W燈泡，照射距離應(yīng)大于85cm。聚合后的膠囊移至室溫在紫外線下繼續(xù)照射2～3天，可增加其硬度，便于切片。
