一、凝集素電鏡標記技術
凝集素的特性及標記原理詳見第五章 ，近年來，凝集素電鏡標記技術應用日益廣泛，且獲得較為滿意的效果。凝集素電鏡標記技術方法較多，常用的有凝集素—酶（常用為HRP)、凝集素—生物素—酶電鏡標記技術�，F(xiàn)將凝集素—酶電鏡標記技術（包埋前染色)簡介如下（Sterit 和Kreatzberg,1987)。
�。�1)固定：常用為PLP或多聚甲醛—戊二醛固定液。如為取腦組織，可將已藻注動物在4℃過夜，次日取腦組織置0.1mol/L磷酸或二甲胂酸鈉緩沖液（含7.5%蔗糖)中漂洗。
�。�2)振動切片機（Vibratome)切60μm的厚片。
�。�3)切片孵育在PBS（內含0.1mol/l CaCl2、Mgcl2和MnCl2)10min（有作者主張此步可省略)。
�。�4)為增強細胞通透性，切片可孵育于含0.1%胰蛋白酶和0.1CaCl2水溶液中，pH7.8,37℃孵育30min。
�。�5)PBS洗3次，每次2min。
�。�6)凝集素—HRp 1：10 在PBS中（含0.1%Triton X--100)4℃過夜，最好不斷輕輕振蕩。
�。�7)PBS洗3次，每次2min。
�。�8)DAB-H2O2顯色。
�。�9)1%OSO4水溶液固定。
�。�10)系列酒精脫水，EPON包埋，切片。
�。�11)電鏡沿—鈾雙染觀察。
凝集素呈高電子密度常沉積在細胞膜上，易與電子染色相區(qū)別。
二、掃描免疫電鏡技術
掃描免疫電鏡技術可為研究細胞或組織表面的三維結構與抗原組成的關系提供可能性。
�。ㄒ�)標記物
應用于掃描電鏡的標記物應能在掃描電鏡可分辨的范圍內，并能對細胞或組織抗原有較好的定位能力。在選擇標記物時應根據(jù)研究目的而定，如標記細胞等由于體積較大，可用體積大的標記物；如鑒別陽性（標記細胞)與陰性（未標記細胞)，而要定位受體等則需選用較小的，易于辨認的標記物。
常用的標記物為顆粒性標記物。依其特性可分為：
1．蛋白類 如血藍蛋白、鐵蛋白等。
2．病原體類 如煙草花葉病毒、南方菜豆花葉病毒、噬菌體T4、大腸桿菌f2、噬菌體等。
3．金屬顆粒膠體金、免疫金銀標記技術和同位素放射性自顯影的銀顆粒等。其中以金屬類顆粒標記物應用最為廣泛。最常用的是膠體金，膠體金商品提供的直徑從3～150nm不等，掃描免疫電鏡常用的金顆粒直徑在30～60nm左右為宜。由于金本身系重金屬，有較強的發(fā)射2次電子的作用，故不需噴鍍金屬膜，這是膠體金應用于免疫掃描電鏡的標記優(yōu)于其它標記物之處。免疫金銀染色能加強細胞或組織表面金屬顆粒聚集的密度。金、銀粒在電鏡顯示為電子密度高，外形清晰的顆粒易于識別和定位。病原體標記物主要利用其特異殊的外形和結構以達到標記定位的目的，如噬菌體T4形似星形的球拍，頭部大約100nm直徑，呈六角形星狀，尾長約100nm，由頸部與頭部相接；煙草花葉病毒為15×30nm的桿狀病毒，而南方菜豆花葉病毒是直徑25nm的園形顆粒，這些病原體的典型外形很易于辨認。鐵蛋白由于含有致密的鐵離子核心具有較高的電子密度，從而達到標記定位的目的。血蛋白是由海螺類軟體動物中提取的多分子聚合物，其外形為35×50nm的柱狀體，多應用于病毒研究，但也有利用血藍蛋白與過氧化物等的糖蛋白部份可與凝集素相結合的特性，進行細胞膜受體的定位。
�。ǘ�)免疫標記方法
金屬類標記物的免疫標記法同切片免疫染色，即將標記物與抗體相結合，通過直接或間接法顯示抗原部位。膠體金可與蛋白A相結合后與IgG分子中的Fc 段相結合。哪與卵白素（a－vidin)相結合可與結合抗體的生物素（biotin)反應。免疫金銀染色法在膠體金標記后，再進行銀液顯影。病毒（包括噬菌體)標記物多采用不標記抗體法，即搭橋法。此法的原理是采用同種動物制備抗原的特異性抗體與標記物抗體（例如兔抗A抗原與兔抗HRP)。再用另一種動物制備第一種動物血清抗體的抗體（例如羊抗兔IgG抗體)。利用后者為橋，把抗原的特異性抗體與抗標記物抗體結合起來，后者再與標記物結合，以達到定位抗原的目的，其基本原理與PAP法類同。病原體免疫標記可不用標記物顯示，而利用其形態(tài)學特征定位或采用抗原抗體凝集法，其基本原理是利用病毒或病毒抗原的特異性抗體在與相應的抗原反應后，使后者之間發(fā)生交聯(lián)而凝集，經(jīng)濃縮后用陰性染色法（負染)便可在電鏡下顯示定位部位。
�。ㄈ�)掃描免疫電鏡的具體操作步驟
1．標本處理
�。�1)細胞懸液：用10ml PBS 內含1mg/ml牛血清白蛋白（PBS—BSa )懸浮細胞，離心250g,5min×2。加入PBS—BSA 至105～106細胞/ml，振搖成單細胞懸液。BSA能減低生物標本的非特異性吸附，但注意濃度應適宜，過高會減弱特異性反應。
�。�2)細胞附著于固體支持物：由于固定與免疫標記的孵育過程會引起細胞凝集，妨礙細胞表面的暴露，而且反復的離心與懸浮會導致細胞表面形態(tài)的改變。因此，通常將懸液中的細胞粘附于過濾膜或涂有帶正電荷聚合物的蓋玻片上，在粘附之前可依（1)法清洗標本，以除去細胞表面的附著物。固體支持物可用涂有多聚—L—賴氨酸薄膜的載片或直徑13nm、孔徑0.22或0.45μm的過濾膜，載片制備方法：多聚—L—賴氨酸（Sigma)100μg/ml重蒸溶解涂抹于載片上，4℃30min后傾倒掉表面液體，令其自然干燥。注意載玻片事先需要清潔液浸泡，水漂洗過夜，然后浸泡于乙醇或丙醇中，用前取出自然干燥或用綢巾拭干。將細胞懸液（如細胞數(shù)少可事先離心，取沉淀細胞)，滴于濾膜或載片上，由于多聚賴氨酸的粘附性，在固定及免疫標記過程中細胞不至于脫落。但注意勿使細胞干燥。
�。�3)組織切片與固體組織：組織切片如為石蠟包埋應預先脫蠟，由二甲苯經(jīng)梯度酒精至水。組織切片與固體組織（勿過大)均應以PBS—BSA沖洗，并保持濕潤避免干燥。
2．固定
�。�1)固定前用PBS—BSA沖洗5min×3。
�。�2)選擇加入適合的固定劑；可為4%多聚甲醛+0.1%～0.5%戊二醛在pH7.4的磷酸緩沖液中。室溫固定10～60min，或4℃30～120min。
�。�3)PBS—BSA沖洗5min×3。
�。�4)除去殘留的自由醛基，選以下任一方法：
�、�0.5mg硼氫化鈉/1ml PBS 10min（新鮮配制)
�、�0.05～0.2mol/l 甘氨醊或賴氨酸—HCl/PBs 30～60min。
�、�0.1～0.5mol/L氯化鈉/PBs 30～60min。
�、躊BS—BSA沖洗5min×3。
3．免疫標記與透射免疫電鏡的原則及步驟基本相同。醫(yī)學全在線www.med126.com
免疫金銀染色法舉例（張留保等，1997)
�。�1)血細胞以PBS—BSA沖洗5min×3。
�。�2)2%多聚甲醛—戊二醛混合液固定，4℃，1h
�。�3)PBS或TBS反復沖洗5min×3。
�。�4)膠體金免疫標記程序（略)
�。�5)暗室顯影液顯影
（6)掃描電鏡樣品制樣
�。�7)觀察
作者在血細胞膜外顯示了密集的金銀粒標記（特異性標記膜的谷胱甘肽過氧化物酶及激素肽)。
4．常規(guī)掃描電鏡標本處理
�。�1)PBS—BSA沖洗5min×3。
�。�2)后固定：2.5%戊二醛0.1mol/L磷酸緩沖液，時間視樣本大小而定，一般室溫30min左右。
�。�3)PBS—BSA洗5min×3。
�。�4)1%四氧化鋨后固定1～2h
�。�5)系列梯度乙醇或丙酮脫水
�。�6)臨界點干燥或冰凍干燥
（7)噴鍍碳與金
�。�8)掃描電鏡觀察
