�。ㄈ�)補(bǔ)體法
1．材料
（1)免疫血清60℃滅活20min，用Kolmers 鹽水作2倍稀釋成1：2，1：4，1：8……。補(bǔ)體用1：10稀釋的新鮮豚鼠血清，抗補(bǔ)體熒光抗體等，按下述的補(bǔ)體法染色。免疫血清補(bǔ)體結(jié)合的效價(jià)，如為1：32則免疫血清應(yīng)作1：8稀釋。
（2)補(bǔ)體用新鮮豚鼠血清一般作1：10稀釋或按補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)試管法所測(cè)定的結(jié)果，按2單位的比例，用Kolmers鹽水稀釋備用。Kolmers鹽水配法：即在pH7.4、0.1mol/L的磷酸緩沖鹽水中，溶解MgSO4的含量為0.01%濃度。
�。�3)抗補(bǔ)體熒光抗體：在免疫血清效價(jià)為1：4，補(bǔ)體為2單位的條件下，用補(bǔ)體染色法測(cè)定免疫豚鼠球蛋白熒光抗體的染色效價(jià)，然后按染色效價(jià)1：4的濃度用Kolmers鹽水稀釋備用。
2．方法步驟
�。�1)涂片或切片固定。
�。�2)吸取經(jīng)適當(dāng)稀釋之免疫血清及補(bǔ)體之等量混合液（此時(shí)免疫血清及補(bǔ)體又都稀釋一倍)滴于切片上，37℃作用30min，置于保持一定濕度的染色盒內(nèi)。
�。�3)用緩沖鹽水洗2次，攪拌，每次5min，吸干標(biāo)本周?chē)骸?/P>
�。�4)滴加經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋之抗補(bǔ)體熒光抗體30min，37℃，水洗同（3)。
�。�5)蒸餾水洗1min，緩沖甘油封固。
3．對(duì)照染色
（1)抗原對(duì)照。
（2)抗血清對(duì)照：用正常兔血清代替免疫血清。
（3)滅活補(bǔ)體對(duì)照：將補(bǔ)體經(jīng)56℃30min處理后，按補(bǔ)體同樣比例稀釋?zhuān)c免疫血清等量混合后，進(jìn)行補(bǔ)體法染色。
本法之熒光抗體不受免疫血清的動(dòng)物種屬的限制，因而一種熒光抗體可作更廣泛的應(yīng)用，敏感性亦較間接法高，效價(jià)低的免疫血清亦可應(yīng)用，節(jié) 省免疫血清，尤其是對(duì)檢查形態(tài)小的如立克氏體、病毒顆粒等或濃度較低的抗原物質(zhì)時(shí)甚為理想。
�。ㄋ�)膜抗原熒光抗體染色法
本法應(yīng)用直接法或間接法的原理和步驟，可對(duì)活細(xì)胞在試管內(nèi)進(jìn)行染色，常用于T和B細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物、瘤細(xì)胞抗原和受體等的檢查和研究，陽(yáng)性熒光主要在細(xì)胞膜上。FACS即采用此法原理。
�。ㄎ�)雙重染色法
在同一標(biāo)本上有兩個(gè)抗原需要同時(shí)顯示（如A抗原和B抗原)，A抗原的抗體用FITC標(biāo)記，B抗原的抗體用羅達(dá)明標(biāo)記，可采用以下染色方法：
1．一步法雙染色 先將兩種標(biāo)記抗體按適當(dāng)比例混合（A+B)，按直接法進(jìn)行染色。
2．二步法雙染色 先用RB200標(biāo)記的B抗體染色，不必洗去，再用FITC標(biāo)記的A抗體染色，按間接法進(jìn)行。
結(jié)果：A抗原陽(yáng)性熒光呈現(xiàn)綠色，B抗原陽(yáng)性呈現(xiàn)桔紅色熒光。
�。�)熒光抗體再染色法
若切片或其他標(biāo)本經(jīng)某種熒光抗體染色后，未獲得陽(yáng)性結(jié)果，而又疑有另外的病原體存在時(shí)，可用相應(yīng)的熒光抗體再染色。
有時(shí)存檔蠟塊不能再用以切片，也可用存檔的HE染色標(biāo)本，褪去蓋片和顏色，再作免疫熒光或其它免疫細(xì)胞化學(xué)的染色。
三、熒光抗原染色法
某些抗原可以用熒光素標(biāo)記，制成熒光抗原，標(biāo)記熒光素的方法與制備熒光抗體方法相同。用熒光抗原可以直接檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗體，特異性較好，敏感性較差。染色方法同熒光抗體染色的直接法。由于多數(shù)抗原難以提純或量少不昂貴，一般很少采用此法。
