衛(wèi)生毒理學(xué)-實(shí)驗(yàn)指導(dǎo):實(shí)驗(yàn)三 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)

通過(guò)本次實(shí)驗(yàn),學(xué)習(xí)和掌握小鼠脊髓多染紅細(xì)胞(PCE)微核的測(cè)定方法.

微核試驗(yàn)是用于染色體損傷和干擾細(xì)胞有絲分裂的化學(xué)毒物的快速檢測(cè)方法。微核是指存在于細(xì)胞中主核之外的一種顆粒，大小相當(dāng)于細(xì)胞直徑的1/20～1/5，呈圓形或杏仁狀，其染色與細(xì)胞核一致，在間期細(xì)胞中可以出現(xiàn)一個(gè)或多個(gè)。一般認(rèn)為微核是細(xì)胞內(nèi)染色體斷裂或紡錘絲受影響而在細(xì)胞有絲分裂后期滯留在細(xì)胞核外的遺傳物質(zhì)。所以，微核試驗(yàn)?zāi)軝z測(cè)化學(xué)毒物或物理因素誘導(dǎo)產(chǎn)生的染色體完整性改變和染色體分離改變這兩種遺傳學(xué)終點(diǎn)。

微核可以出現(xiàn)在多種細(xì)胞中，但在有核細(xì)胞中較難與正常核的分葉及核突出物相區(qū)別。由于紅細(xì)胞在成熟之前最后一次分離后數(shù)小時(shí)可將主核排出，而仍保留微核于PCE細(xì)胞中，因此通常計(jì)數(shù)PCE細(xì)胞中的微核。

1  器材  手術(shù)刀、手術(shù)剪、無(wú)齒鑷、小型彎止血鉗、干凈紗布、帶橡皮頭吸管、臺(tái)式離心機(jī)、刻度離心管、晾片架、電吹風(fēng)機(jī)、玻璃蠟筆、玻璃染色缸、2ml注射器及針頭、載玻片及推片、定時(shí)鐘、帶油鏡頭顯微鏡、細(xì)胞計(jì)數(shù)器。

2  試劑  甲醇(分析純)、甘油(分析純)、小牛血清、生理鹽水、Giemsa儲(chǔ)備液(取Gm.zxtf.net.cn/kuaiji/iemsa染料1g，甘油66ml，甲醇60ml。先將染料置于研缽內(nèi)，加入少量甘油混合研細(xì)，再分次傾人剩余的甘油繼續(xù)研磨，然后轉(zhuǎn)移至燒杯內(nèi)，蓋上玻璃表面皿，置60^oC水浴2h，取出待冷卻后加入甲醇，混合靜置2周后，過(guò)濾于棕色瓶?jī)?nèi)，存放陰涼處。該儲(chǔ)備液存放的時(shí)間越長(zhǎng)，染色效果越好。臨用時(shí)用pH6.8的磷酸鹽緩沖液配制為10％的應(yīng)用液)、pH6.8的磷酸鹽緩沖液。

(1)I/15mol/L磷酸二氫鉀(KH₂P0₄)溶液：稱取分析純KH₂P0₄ 9.06g，用蒸餾水溶解并定容至1000ml。

(2)1/15mol/L磷酸氫二鈉(Na₂HPO₄)溶液：稱取分析純Na₂HPO₄，9.45g(或Na₂HPO₄·2H₂0 11.87g；Na₂HPO₄·7H₂0 17.87g；Na₂HPO₄·12H₂0 23.88g)用蒸餾水溶解并定容至1000ml。

(3)pH6.8的磷酸鹽緩沖液：取l/15mol/L的磷酸二氫鉀溶液50.40 ml和1/15mol／L的磷酸氫二鈉溶液49.60ml，兩者混合均勻即成。

3．陽(yáng)性對(duì)照物  環(huán)磷酰胺或絲裂霉素C。

1．試驗(yàn)動(dòng)物及處理

(1)動(dòng)物選擇：一般常用的試驗(yàn)動(dòng)物為大、小鼠。以小鼠使用最為廣泛，要求體重18～20g，7~12周齡。每組小鼠數(shù)量10只，雌雄各半。

(2)染毒途徑：根據(jù)研究目的或受試化學(xué)毒物性質(zhì)的不同，可分別選用經(jīng)口、經(jīng)皮、經(jīng)呼吸道及注射等染毒途徑。但原則上應(yīng)盡可能采用與人體接觸化學(xué)毒物相同的途徑。

(3)染毒次數(shù)及取樣時(shí)間：研究證實(shí)化學(xué)毒物需在靶器官內(nèi)蓄積至一定的濃度才具有致突變作用。不同化學(xué)毒物誘發(fā)微核出現(xiàn)的高峰時(shí)間也不盡相同。波動(dòng)范圍可以達(dá)到24～72h。這就要求在接觸化學(xué)毒物后設(shè)立不同的采樣時(shí)間點(diǎn)。考慮到以上兩方面的原因，建議采用多次染毒的方法。其中以4次染毒比較方便合理。即每天染毒一次，連續(xù)4天，第5天取樣。這樣，取樣一次就能覆蓋24～72h高峰，如果高峰延遲到96h也不會(huì)漏掉。

(4)劑量選擇：受試化學(xué)毒物的最大劑量除受溶解度大小所限外，應(yīng)達(dá)到最大耐受量。葉般情況下，應(yīng)設(shè)3～5個(gè)或更多劑量組，劑量覆蓋的范圍要達(dá)到3個(gè)數(shù)量級(jí)以上。同時(shí)還應(yīng)設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組。陽(yáng)性對(duì)照組可用環(huán)磷酰胺(50~100mg／kg)或絲裂霉素C(10mg／kg)腹腔注射1次或2次。陰性對(duì)照組使用等體積的溶劑。

2．骨髓液的制備和涂片  試驗(yàn)動(dòng)物最后一次染毒后，按確定的時(shí)間用頸椎脫臼或麻醉，的方法將其處死，四肢固定于解剖板，將腹中線被毛浸濕，剖開胸腹部，取下胸骨，擦凈血污，剔去肌肉，剪去骨骺，用小型彎止血鉗將骨髓擠于有一滴小牛血清的清潔載玻片上，混合均勻后推片。也可在動(dòng)物處死后，迅速用手術(shù)剪將其兩腿股骨取下，剔去肌肉，用生理鹽水洗去血污和碎肉，剪去兩端的骨骺，用帶針頭的2ml注射器吸取小牛血清，插人骨髓腔內(nèi)，將骨髓沖人離心管，然后用吸管吹打骨髓團(tuán)塊使其均勻，以1000r／min離心10min，棄去多余的上清液，留下約0.5ml與沉淀物混勻后，用滴管吸取并滴一滴在清潔的載玻片上，推片。陽(yáng)性及陰性對(duì)照組按上述方法同時(shí)進(jìn)行處理。

3．固定  將推好晾干的骨髓片放人染色缸中，用甲醇溶液固定15min，取出晾干。不能及時(shí)染色的涂片也應(yīng)固定后保存。

4．染色  將固定晾干后的涂片，用新鮮配制．的Giemsa應(yīng)用液(Giemsa儲(chǔ)備液l份加pH6.8的磷酸鹽緩沖液9份)染色10~15min，然后沖洗掉玻片上的染色液，置晾片架上晾干。

5．觀察計(jì)數(shù)  先在低倍鏡下進(jìn)行觀察，選擇分布均勻，染色較好的區(qū)域，再在油鏡下觀察計(jì)數(shù)，PCE細(xì)胞呈灰藍(lán)色，正染紅細(xì)胞(NCE)呈橘黃色。細(xì)胞中含有的微核多數(shù)呈圓形，邊緣光滑整齊，嗜色性與核質(zhì)一致，呈紫紅色或藍(lán)紫色。一個(gè)細(xì)胞內(nèi)可出現(xiàn)一個(gè)或多個(gè)微核。計(jì)數(shù)1000個(gè)PCE中含微核的PCE數(shù)，并且計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞中PCE與NCE的比值。

本試驗(yàn)中只計(jì)數(shù)PCE中的微核，微核率以千分率表示。每只動(dòng)物為一觀察單位。每組的雌、雄動(dòng)物分別計(jì)算微核PCE的均值。雌、雄動(dòng)物之間無(wú)明顯的性別差異時(shí)可合并計(jì)算結(jié)果，否則應(yīng)分別進(jìn)行計(jì)算；正常的PCE／NCE比值約為1(正常范圍為0.6～1.2)。如比值<0.1，則表示PCE形成受到嚴(yán)重抑制，受試化學(xué)毒物的劑量過(guò)大，試驗(yàn)結(jié)果不可靠。陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組的微核發(fā)生率，應(yīng)與試驗(yàn)所用動(dòng)物種屬及品系的文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果或者是與研究的歷史數(shù)據(jù)相一致。