醫(yī)學(xué)微生物學(xué)-實(shí)驗(yàn)指導(dǎo):實(shí)驗(yàn)二十六 核酸擴(kuò)增技術(shù)

實(shí)驗(yàn)二十六 核酸擴(kuò)增技術(shù)

最常用的核酸擴(kuò)增方法是聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechain reaction，PCR)。

【原理】

PCR技術(shù)是在模板DNA、引物和4種脫氧核糖核苷存在的條件下依賴于DNA聚合酶的酶促反應(yīng)，是一種體外擴(kuò)增特異DNA片段的方法，其特異性取決于引物和模板DNA結(jié)合的特異性。反應(yīng)分三步：①變性：加熱使雙鏈DNA解離成單鏈DNA。②退火：引物和其互補(bǔ)的模板DNA結(jié)合形成雜交鏈。③延伸：在DNA聚合酶的催化下。以引物為起始點(diǎn)的DNA鏈進(jìn)行延伸。以上三步為一個(gè)循環(huán)，每一循環(huán)產(chǎn)物可作為下一個(gè)循環(huán)的模板。數(shù)小時(shí)之后，介于兩個(gè)引物之間的特異性DNA片段得到了大量擴(kuò)增，數(shù)量可達(dá)2×10^6~7拷貝。

【反應(yīng)成分】

1．引物(primer)是DNA聚合酶啟動DNA合成時(shí)所必需的一段寡核苷酸。

2．TaqDNA聚合酶。

3．反應(yīng)緩沖液  PCR反應(yīng)的緩沖液常用含10～50mmol/LTris·HCl，50mmol/L KCl₂的溶液，聚合反應(yīng)溫度下pH為7.2，但各實(shí)驗(yàn)室該緩沖液配方可能不同。

4．dNTPs、模板(靶基因)DNA。

【反應(yīng)體系】

標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系：（100μl)

　　 　10×擴(kuò)增緩沖液  10μl
　　　　　　 Mg²⁺(1.5mmol/L) 6μl
4種dNTP混合物(各200μmol/L)   2μl
　　　　　　 上下游引物(各10～100pmol)　 各2μl
　　　　　　 模板DNA(0.1～2μg)　2～4μl
　 　　　　　Taq DNA聚合酶(2.5u)　 &nbswww.med126.comp;1μl
　　　　　　 加雙或三蒸水至  100μl

【擴(kuò)增流程】

一般PCR擴(kuò)增流程：

94℃ (預(yù)中國衛(wèi)生人才網(wǎng)變性)　  5min

94℃ (變性)　　 30s～1min

55～60℃  （退火) 30s～1min   30～35次循環(huán)

72℃   （延伸)  1～2min

72℃   （終延伸)  5～10min

4℃ （保溫)