實驗九 球菌
球菌種類繁多，廣泛分布于自然界和正常機體，大多為非致病性球菌；少數(shù)為致病性球菌，主要引起人體化膿性感染。根據(jù)革蘭染色性不同，分為革蘭陽性球菌和革蘭陰性球菌兩類，其中革蘭陽性球菌有葡萄球菌、鏈球菌、肺炎鏈球菌等；革蘭陰性球菌有腦膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌等。
一、葡萄球菌屬
葡萄球菌屬(Staphylococcus)為革蘭陽性球菌，呈葡萄串狀排列，無鞭毛、無芽胞、某些菌株有莢膜。營養(yǎng)要求不高，需氧或兼性厭氧。根據(jù)其細(xì)胞壁組成、血漿凝固酶及毒素產(chǎn)生以及致病性不同分為金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌及腐生葡萄球菌。
金黃色葡萄球菌是主要的致病性葡萄球菌，能產(chǎn)生金黃色色素、血漿凝固酶、溶血毒素，能分解甘露醇，某些菌株還能合成腸毒素。在臨床上主要引起化膿性炎癥、敗血癥或食物中毒。
（一)形態(tài)與培養(yǎng)特性
【材料與方法】
1．取金黃色、表皮、腐生葡萄球菌各接種一個血平板，37℃培養(yǎng)18～24h，觀察其菌落特點。
2．金黃色、表皮葡萄球菌瓊脂斜面18～24h培養(yǎng)物，革蘭染色，鏡檢。
【結(jié)果】
1．血平板上的菌落：金黃色、表皮、腐生葡萄球菌菌落均為圓形、濕潤、光滑、邊緣整齊的菌落，各自形成金黃色、白色、檸檬色脂溶性色素，金黃色葡萄球菌常形成透明的完全溶血環(huán)(β-溶血環(huán))。
2．革蘭染色片鏡檢：可見到呈葡萄串狀聚集的革蘭陽性球菌。
（二)血漿凝固酶試驗
血漿凝固酶是致病性葡萄球菌的主要特征，大多數(shù)金黃色葡萄球菌能產(chǎn)生此酶。分游離型凝固酶和結(jié)合型凝固酶兩種。游離型凝固酶在有凝固酶反應(yīng)因子存在的條件下，可使纖維蛋白原變成纖維蛋白，導(dǎo)致血漿凝固，常用試管法檢測。結(jié)合型凝固酶存在于菌體表面，為纖維蛋白原受體，可與纖維蛋白交聯(lián)而使細(xì)菌凝聚，常用玻片法檢測。
1．玻片法
【材料】
(1) 金黃色、表皮葡萄球菌瓊脂斜面18～24h培養(yǎng)物。
(2) 兔(或人)血漿、生理鹽水。
(3) 毛細(xì)吸管、玻片、接種環(huán)等。
【方法】
(1) 將玻片劃分成3格，用毛細(xì)吸管在第3格中加1滴生理鹽水，第1及第2格中加1滴兔(或人)血漿。
(2) 從瓊脂斜面挑取金黃色葡萄球菌，分別混懸于第3格和第1格內(nèi)，第2格中混懸表皮葡萄球菌，靜置片刻，觀察結(jié)果。
【結(jié)果】
第3格和第2格不凝集；第1格中金黃色葡萄球菌凝集成塊，即判定為血漿凝固酶陽性。
2．試管法
【材料】
(1) 金黃色、表皮葡萄球菌瓊脂斜面18～24h培養(yǎng)物。
(2) 兔(或人)血漿、生理鹽水。
(3) 1ml刻度吸管，小試管。
【方法】
(1) 用刻度吸管，將生理鹽水與兔血漿1∶4稀釋，然后分別取0.5ml加入2支小試管內(nèi)。
(2) 從斜面上分別挑取金黃葡萄球菌和表皮葡萄球菌各數(shù)環(huán)于血漿管內(nèi)，制成細(xì)菌懸液。置37℃水浴30min，觀察結(jié)果。
【結(jié)果】
接種金黃色葡萄球菌管中血漿凝固，接種白色葡萄球菌管中血漿不凝固，前者為凝固酶試驗陽性。
二、鏈球菌屬
鏈球菌屬(Streptococcus)是革蘭陽性球菌，成雙或成鏈排列。無芽胞，無鞭毛，幼齡菌株具有由透明質(zhì)酸形成的莢膜，有些菌株有菌毛。為需氧或兼性厭氧菌，營養(yǎng)要求較高，在液體培養(yǎng)基中易形成長鏈而呈沉淀生長方式。根據(jù)不同菌株在血平板上的溶血能力，將鏈球菌分為甲型溶血性鏈球菌、乙型溶血性鏈球菌、丙型鏈球菌。
（一)形態(tài)與培養(yǎng)特性
【材料與方法】
(1) 取甲、乙、丙型3種鏈球菌的血瓊脂斜面18～24h培養(yǎng)物分別涂片，作革蘭染色，鏡檢。
(2) 取上述3種鏈球菌，以劃線接種法分別接種于血瓊脂平板上，置37℃培養(yǎng)18～24h，觀察結(jié)果。
【結(jié)果】
(1) 革蘭染色片鏡檢：可見到呈鏈狀排列，長短不一的革蘭陽性球菌。
(2) 血平板上的菌落：甲型溶血性鏈球菌形成草綠色溶血現(xiàn)象，乙型溶血性鏈球菌形成透明的完全溶血現(xiàn)象，丙型鏈球菌無溶血現(xiàn)象。
（二)抗鏈球菌溶血素“O”試驗
【原理】
A族鏈球菌產(chǎn)生的溶血素“O”為蛋白質(zhì)，具有很強的免疫原性，多數(shù)人感染該菌后，血清中出現(xiàn)較高水平的抗“O”抗體，并可至病愈后數(shù)月至數(shù)年才消失。因此，測定患者血清中抗O抗體的效價，可以作為其感染性疾病(如風(fēng)濕熱及急性腎小球腎炎)的輔助診斷。
本實驗是在受檢標(biāo)本中加入適量的溶血素“O”。如標(biāo)本中含有高濃度抗體，中和后則有多余抗體存在，經(jīng)與溶血素“O”致敏的膠乳試劑反應(yīng)，即可發(fā)生肉眼可見的凝集�？埂癘”試驗的效價是指完全不凝集的血清最大稀釋度。一般正常人其效價在500u內(nèi)，大于500u有診斷意義。
【材料】
(1) 病人血清、生理鹽水。
(2) 診斷試劑盒
R1 溶血素“O”溶液
R2 ASO膠乳試劑
R3 陽性對照血清
R4 陰性對照血清
【方法】
(1) 將血清標(biāo)本用生理鹽水作1∶50稀釋。
(2) 取稀釋樣本、陰陽性對照各1滴(約50μl)，分別加入溶血素“O”溶液1滴，于黑色背景反應(yīng)孔內(nèi)，混勻搖動2min。
(3) 加ASO膠乳試劑1滴混勻，輕輕搖動，5min內(nèi)(室溫18～25℃)觀察結(jié)果。
【結(jié)果判斷】
規(guī)定時間內(nèi)出現(xiàn)凝集者為陽性，不出現(xiàn)凝集者(ASO≤250u/ml)為陰性。必要時陽性標(biāo)本可進一步作1∶80或1∶100稀釋，重復(fù)操作步驟2和3。
其稀釋度與ASO滴度大致關(guān)系為：
血清稀釋度ASO滴度
1∶50≥500
1∶80 ≥800
1∶100 ≥1000
三、肺炎鏈球菌
肺炎鏈球菌(S. pneumoniae)，俗稱肺炎球菌(pneumococcus)，菌體呈矛頭狀，成雙排列，尖端向外，革蘭陽性球菌。無芽胞，無鞭毛，有明顯的多糖莢膜。在固體培養(yǎng)基上由于產(chǎn)生自溶酶而形成“肚臍”一樣特殊菌落。能分解菊糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。對膽汁或膽鹽和Optochin敏感。
（一)形態(tài)與培養(yǎng)特性
【材料與方法】
1．取肺炎球菌接種于血平板上，37℃培養(yǎng)18～24h，觀察其菌落特點。
2．肺炎球菌血瓊脂平板18～24醫(yī)學(xué)招聘網(wǎng)h培養(yǎng)物，革蘭染色，鏡檢。
【結(jié)果】
１．菌落圓形，光滑，中間凹陷，邊緣隆起，帶粘性。菌落周圍有草綠色溶血環(huán)。
２．肺炎球菌呈矛頭狀，成雙排列，尖端向外，具有肥厚的莢膜，革蘭陽性菌。
（二)Optochin敏感試驗
Op醫(yī)學(xué)全.在線tochin即乙基氫化羥基奎寧，水溶液比較穩(wěn)定，可冷藏數(shù)周，亦可高壓蒸氣滅菌。幾乎所有肺炎球菌都對Optochin敏感，而甲型鏈球菌則不敏感，故此試驗可鑒別這兩種細(xì)菌。
【材料與方法】
1．將肺炎球菌和甲型鏈球菌分別涂布接種血瓊脂平板各1個。
2．把直徑6mm的濾紙片放人l∶4000 Optochin水溶液中，浸濕后分別貼于涂有菌的平板上，37℃培養(yǎng)18h，觀察結(jié)果。
【結(jié)果】
肺炎球菌平板的濾紙片周圍可見直徑大于20mm的抑菌圈，鏈球菌則無或直徑小于l0mm的抑菌圈。
四、奈瑟菌屬
奈瑟菌屬(Neisseria)為革蘭陰性雙球菌，無鞭毛，無芽胞，有菌毛。對人體致病的有腦膜炎奈瑟菌(腦膜炎球菌)、淋病奈瑟菌(淋球菌)。
（一)形態(tài)與培養(yǎng)特性
【材料與方法】
1．觀察腦膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌革蘭染色片，注意細(xì)菌的形態(tài)、排列及染色性。
2．取急性病人的膿性分泌物標(biāo)本，直接涂片，革蘭染色，鏡檢。
【結(jié)果】
1．腦膜炎奈瑟菌菌體呈腎形，成雙排列，凹面相對，革蘭陰性菌；淋病奈瑟菌呈咖啡豆形，成雙排列，革蘭陰性菌。
2．可見在中性粒細(xì)胞內(nèi)外，有革蘭陰性雙球菌。
（二)腦脊液直接涂片檢查
【材料與方法】
1．將新鮮腦脊液標(biāo)本，于3000rpm離心30min。
2．去上清液，取沉淀涂片，革蘭染色，鏡檢。
【結(jié)果】
若發(fā)現(xiàn)腎形、成雙排列的革蘭陰性球菌，并多數(shù)位于中性粒細(xì)胞內(nèi)者，多為腦膜炎奈瑟菌。
