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公共衛(wèi)生醫(yī)學(xué)論文酶消化結(jié)合組織塊培養(yǎng)法
1 引言
TMJ 是人體內(nèi)最復(fù)雜的關(guān)節(jié)之一，其運(yùn)動(dòng)和功能中心位于下頜骨髁狀突和顳骨關(guān)節(jié)面之間無血管的纖維軟骨組織--關(guān)節(jié)盤，而大約70%的TMJ 關(guān)節(jié)紊亂病(temporomandibulardisorder, TMD)與關(guān)節(jié)盤病變有關(guān)，主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)盤變薄、透明樣變、穿孔等特征。迄今為止，臨床治療的主要目的在于恢復(fù)關(guān)節(jié)盤的生物力學(xué)功能和緩解癥狀，治療方法雖多，但沒有一種可治愈此病的好方法。關(guān)節(jié)盤組織工程的興起為治療關(guān)節(jié)盤疾病提供了一個(gè)有較好前景的治療新方法，但由于自體關(guān)節(jié)盤纖維軟骨組織量少、取材困難，如何運(yùn)用少量的關(guān)節(jié)盤組織，在適宜的條件下分離及培養(yǎng)獲取數(shù)量多、活性高及分化功能良好的種子細(xì)胞是當(dāng)前TMJ 關(guān)節(jié)盤組織工程的重要問題之一。近年來，有關(guān)TMJ 關(guān)節(jié)盤組織工程研究中關(guān)節(jié)盤細(xì)胞的體外培養(yǎng)多為采用II 型膠原酶一步消化法[5-11]。但是，微量的關(guān)節(jié)盤組織經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的酶解后細(xì)胞的損失量較大，獲得的細(xì)胞數(shù)量較少，不利于細(xì)胞的大量增殖。若按照文獻(xiàn)中提供的方法獲取關(guān)節(jié)盤細(xì)胞則需要大量的TMJ 關(guān)節(jié)盤自體組織，必然增加研究的成本和費(fèi)用。本實(shí)驗(yàn)嘗試使用組織塊培養(yǎng)結(jié)合酶消化法對(duì)關(guān)節(jié)盤細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)研究，為體外擴(kuò)增關(guān)節(jié)盤細(xì)胞進(jìn)行組織工程研究提供一種新的方法。
2 材料與方法
2.1 方法
2.1.1 關(guān)節(jié)盤纖維軟骨細(xì)胞的分離實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)本來自當(dāng)?shù)赝涝讖S，1 月齡山羊共8 只，每只質(zhì)量約10kg。在無菌條件下完整切取山羊雙側(cè)TMJ 關(guān)節(jié)盤，用含100 U/ml 雙抗（青霉素、鏈霉素)的PBS 液沖洗3 次，修剪去周圍組織。放入盛有無血清的高糖DMEM 滅菌培養(yǎng)皿中，用眼科剪將關(guān)節(jié)盤纖維軟骨組織剪成1.0 mm3 大小的碎塊后移入三角燒瓶中，加入5 倍體積的0．25％胰蛋白酶， 37℃恒溫?fù)u床中振蕩消化30 min 后，用含雙抗的PBS 洗滌二次。再加入0.01% I 型膠原酶繼續(xù)消化3h，含雙抗的PBS 洗滌二次。將消化好的關(guān)節(jié)盤組織塊以每孔9 塊，距離 5～10mm的密度置入6 孔培養(yǎng)板中，并在組織塊表面放置一24×24 mm 的蓋玻片，輕壓，防止加入培養(yǎng)液時(shí)組織塊浮起。
2.1.2 原代培養(yǎng)
向上述接種有組織塊的培養(yǎng)板中緩慢加入DMEM 培養(yǎng)液(含10% 胎牛血清，100 U/ml靑、鏈霉素，25 mg/L 抗壞血酸)，于5％CO2 飽和濕度、37℃恒溫箱下培養(yǎng)，72h 后半量換液，以后隔日換液逐日在相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。醫(yī).學(xué).全.在.線網(wǎng)站提供。
