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2.2 1mmol/L Lig對Glu誘導海馬神經元保護作用的形態(tài)學變化 Glu作用于細胞20min，繼續(xù)培養(yǎng)12h后顯微鏡下觀察，發(fā)現部分細胞變圓，胞體腫脹，細胞失去原有形態(tài)，突起淡化、減少或消失。細胞內、外出現較多的黑色顆粒，貼壁不牢，折光性下降(圖2)。 Lig保護組與Glu損傷組相比，神經元的胞體較完整，大部分細胞的存在少量的突起。細胞突起存在少量的聯系，突起的數量較正常組減少。
2.3 AChE免疫細胞化學染色結果 鏡下可見棕色顆粒為陽性反應物，免疫組化陰性對照組未見此棕色顆粒。陽性神經元呈現三角形、橢圓形或圓形，突起明顯。陽性反應物主要分布在細胞胞漿中，細胞核及突起著色較淡。與正常對照組和Lig保護組相比較，Glu損傷組細胞明顯淺淡(圖3)。對免疫組化結果進行半定量分析，結果發(fā)現正常組細胞的平均灰度值為148.6±9.88，Glu損傷組細胞的平均灰度值為171.5±6.87，Lig保護組平均灰度值為151.0±12.37。統(tǒng)計分析結果表明正常組灰度值低于Glu損傷組(P<0.01)，Lig保護組灰度值低于Glu損傷組(P<0.05)，正常組和保護組之間無統(tǒng)計學差異(表1)。表1 Lig對Glu損傷培養(yǎng)海馬神經元的保護作用
2.4 Lig對Glu損傷的海馬神經元活性和LDH的影響 MTT法檢測各組海馬神經元活性(表1)。結果顯示，與對照組相比，Glu損傷后細胞活性顯著下降(P<0.001); Lig保護組與Glu損傷組相比細胞活性明顯升高(P<0.05)。Glu損傷后12h，分別檢測各孔培養(yǎng)上清中LDH的活力(表1)。結果顯示Glu損傷可導致海馬神經元LDH釋放顯著增加，表現為培養(yǎng)上清LDH活力顯著增加(P<0.01)，1mmol/L 的Lig可顯著抑制Glu損傷神經元LDH的釋放(P<0.05)。
3 討 論
Lig是中藥川芎的有效成分，在治療缺血性腦血管病等方面療效肯定，而且對中樞神經系統(tǒng)損傷有較好的修復作用。研究表明Lig可明顯抑制皮質和海馬NOS陽性細胞增多，與NOS拮抗劑LNAME(10mg/kg)的作用相似;腦缺血時使用鹽酸Lig注射液可顯著降低細胞外興奮性氨基酸神經遞質Glu和天冬氨酸(Asp)的濃度[4]。Glu是哺乳動物腦內含量最高的興奮性氨基酸之一。許多中樞神經系統(tǒng)疾病可引起Glu的過度釋放,從而產生嚴重的神經興奮毒性，引起神經元損傷或死亡。海馬是腦內對缺血、缺氧最為敏感的部位之一。與皮層神經元相比，海馬神經元易純化而且含有高密度的Glu受體[5]。原代培養(yǎng)細胞比細胞株更接近生理狀態(tài)的生物學特性，選用其探討藥物的作用機制具有實際意義。因此，本研究選用原代培養(yǎng)大鼠海馬神經元，模擬體內高濃度Glu條件，研究Lig對抗Glu興奮性毒性作用，以探討Lig保護神經元損傷的可能機制醫(yī).學全.在.線網站m.zxtf.net.cn。
本實驗結果表明，Lig可以保護Glu誘導的神經元損傷。在細胞培養(yǎng)過程中，Lig保護組神經元的胞體接近正常培養(yǎng)狀態(tài)下的細胞形態(tài)，細胞貼壁情況較Glu損傷組明顯改善。同時，MTT結果表明，Lig保護組細胞活性明顯得到提高，降低Glu引起的神經細胞死亡率。LDH漏出率實驗表明，Glu能引起神經細胞內大量LDH的釋放，LDH釋放率可反映細胞膜的通透性及完整性[6]，而Lig能明顯降低神經細胞LDH的釋放，說明Lig能很好的保護細胞膜的穩(wěn)定性。乙酰膽堿是中樞神經系統(tǒng)一種重要的神經遞質，海馬內有豐富的膽堿能神經遞質存在，其纖維主要來源于隔區(qū)的內側隔核和斜角帶垂直支的膽堿能神經元。膽堿酯酶(AChE)的基本作用是快速水解神經終末的乙酰膽堿，在哺乳動物皮質有AChE的表達，海馬中非膽堿能神經元也有表達[78]。研究發(fā)現，在早期培養(yǎng)胚胎海馬神經元中可大量表達AChE，隨著培養(yǎng)時間的延長，其表達量逐漸下降。AChE對發(fā)育過程中海馬Glu能神經元樹突的形成至關重要[9]。本實驗結果表明，Glu的細胞毒性抑制了細胞合成AChE，表現為細胞的突起減少、突起與突起之間的聯系減少、相應的突觸結構減少，結果影響了神經元的生長。相反，Lig明顯可以對抗Glu的毒性作用，促進細胞AchE的合成，促進神經細胞的發(fā)育成熟。當然，Lig保護Glu介導的細胞毒性作用的詳細機制還有待進一步研究。
