1.1 動物、試劑及儀器
健康SD大鼠35只,雌雄不限,體質量約350g,由江蘇大學動物實驗中心提供,動物使用許可證:SCXK(蘇)20020045, 于本院中心實驗室動物房飼養(yǎng),光照晝夜交替,房間溫度20~26 ℃,濕度低于80%。異丙醇、無水乙醇、氯丙醇(國藥集團化學試劑有限公司),Trizol(Invitrogen公司),DEPC水(上海生工生物工程有限公司),逆轉錄及RTRCR試劑盒(TaKaRa公司),高速離心機(Eppendolf centrifuge 5804R,德國),紫外分光光度計(Eppendolf Biophotometer,德國),RTPCR儀器(MX3000P real time PCR,美國Stratagene公司)。
1.2 方 法
1.2.1 動物模型的制作 精選體質量、年齡都相當?shù)拇笫?稱重后0.2%(0.2 ml/100 g)鹽酸氯胺酮腹腔注射,麻醉成功后固定大鼠于鼠板,備皮手術區(qū),消毒,沿肌間隙分離顯露左側股骨,于股骨干中部離斷一骨段,包括骨外膜,按骨髓腔直徑大小選擇相應規(guī)格克氏針髓腔內固定,造成5 mm股骨骨缺損,沖洗傷口,抗生素預防感染,逐層縫合至皮膚,右側股骨同樣按上述程序處理,但不做骨缺損而直接縫合傷口,后期取材作為正常對照以計算缺損區(qū)相對于正常骨組織的相對擴增倍數(shù)。造模后大鼠置于鼠籠中自由活動,飼料正常喂養(yǎng),每天觀察活動和進食情況至傷口愈合。
1.2.2 實驗分組 分為取材前35天、28天、21天、14天、7天、3天、1天7個時段,每個時段隨機選取5只SD大鼠造模,同一天處死取材。實驗組和對照組均標記骨缺損中心區(qū)和外周區(qū)。
1.2.3 RNA的提取 取出凍存標本組織,按標記的外周區(qū)和中心區(qū)分別取材。中間缺損區(qū)域定為中心區(qū)(即缺損區(qū)域中心點向遠近端各2.5 mm的范圍),中心區(qū)邊緣向遠近端各5 mm定為邊緣區(qū)(即缺損區(qū)域中心點向遠近端2.5~7.5 mm的范圍)。稱重約90 mg的組織置于無菌的研缽中,液氮研磨至粉末狀,按Trizol法提取總RNA,紫外分光光度計測光密度值,檢測各樣品中總RNA的含量及純度,-20 ℃保存醫(yī).學全.在.線網站m.zxtf.net.cn。
1.2.4 引物設計 BMP2基因:上游CGGAAGCGTCTTAAGTCCAG、下游CATGCCTTAGGGATTTTGGA;β肌動蛋白基因:上游ATGTTTGAGACCTTCAACAC、下游CACGTCACACTTCATGG。
上述待測基因從基因庫中查出,引物由上海生工設計合成。
1.2.5 逆轉錄 按照試劑盒說明書操作。
1.2.6 PCR反應 SYBR Green法,具體操作按照TaKaRa公司試劑盒說明書進行擴增。
1.2.7 結果計算 對照組SD大鼠股骨作為陽性對照,以去離子水作為陰性對照。所有樣本PCR反應均做復孔,取其平均值作為結果。以公式2-△△CT計算骨缺損模型外周區(qū)及中心區(qū)BMP2基因在相應區(qū)域相對于正常骨組織的表達倍數(shù)[1]。
1.2.8 統(tǒng)計學方法 利用統(tǒng)計軟件SPSS13.0。BMP2在各個時段外周區(qū)和中心區(qū)的表達比較,采用獨立兩樣本t檢驗; BMP2在外周區(qū)和中心區(qū)各個觀察時段的表達比較,用單因素方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2 結 果