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醫(yī)學免費論文:深部真菌感染的分子生物學檢測研究進展
關鍵詞：分子生物學 真菌病
深部真菌感染指真菌侵犯皮下組織、黏膜和內臟所引起的感染性疾病, 包括局限性的單一器官感染和2個或2個以上器官或組織受侵犯的系統(tǒng)性真菌感染。深部真菌感染發(fā)病率逐年增高, 其病死率高, 癥狀變化多樣, 早期診斷方法有限。本文就分子生物學方法在深部真菌感染診斷中的研究現(xiàn)狀作一綜述。
1流行現(xiàn)狀
深部真菌感染多發(fā)生在醫(yī)院內, 主要由念珠菌、曲霉菌和隱球菌所致。其中念珠菌仍是血液系統(tǒng)感染的主要致病菌。念珠菌感染中以白色念珠菌、熱帶念珠菌感染多見, 但近年來隨著新一代抗真菌藥物的應用, 光滑念珠菌和克柔念珠菌感染患者增多, 并出現(xiàn)耐藥。曲霉菌是繼念珠菌之后第二常見的真菌病原體, 臟器移植患者的曲霉菌感染發(fā)生率高達30% , 病死率達60%～90%。隱球菌的主要致病類型是新型隱球菌, 隱球菌感染是艾滋病常見的并發(fā)癥。
一項覆蓋64% 丹麥人群的調查發(fā)現(xiàn), 2004/2006 年的真菌血癥的年平均發(fā)病率為10. 4/100 000, 每年增加17%。流行病學顯示不僅病原菌的種類發(fā)生了變化, 且隨著新型抗真菌藥物的應用, 真菌的耐藥性也發(fā)生了變化。Sar等利用Etest法檢測402株新型隱球菌對氟康唑的敏感性, 2a間對氟康唑耐藥的菌株增加了11. 5%。
2深部真菌感染的非培養(yǎng)方法
2. 1血清學檢測目前應用于臨床真菌血清學檢測方法主要是檢測血循環(huán)中的抗原, 包括β－D－1, 3葡聚糖(BDG)和半乳甘露聚糖(GM)。BDG 是除接合菌和隱球菌以外的真菌胞壁的主要成分之一, 不存在于細菌、病毒和人類細胞中, 是一種真菌廣譜循環(huán)標志物可用于念珠菌病及曲霉病的早期診斷。GM是存在于曲霉和青霉細胞壁上的一種熱穩(wěn)定多糖, 是第一個用于侵襲性曲霉病的抗原, 其商品化檢測試劑盒在歐洲已經使用了10a余, 美國也于近年批準臨床使用。GM檢測標本可以使用血液或支氣管肺泡灌洗液以及尿液、腦脊液等標本。血清學方法方便快速, 然而不能精確到真菌的種, 對治療用藥有一定影響; 且某些食物、藥物也可影響檢測結果, 目前沒有廣泛應用于臨床。
2. 2分子生物學方法DNA指紋技術包括限制性片斷長度多態(tài)性分析(RFLP)、隨機擴增多態(tài)性分析(RAPD)、電泳核型(elect ropho ret ic karyo type) 等。對于已知分類的微生物, 可通過DNA 片斷比較株系間的同源差異, 對于未知微生物需通過標準菌種DNA 指紋圖庫比較后確定醫(yī).學全.在.線網站m.zxtf.net.cn。
基于聚合酶鏈反應(PCR) 的分子生物學方法如巢式PCR、實時熒光定量PCR 等是目前真菌感染診斷中最活躍的領域, 關鍵是根據(jù)目的基因設計合適的引物。最常選用的目的片段是rDNA 復合體。真核生物編碼核糖體核酸的基因(rDNA)是一個串聯(lián)的重復轉錄單位, 即18S rDNA－ITS－5. 8S rDNA－28SrDNA , 約100～ 200 拷貝, 包括編碼區(qū)和非編碼區(qū); 分隔編碼區(qū)18S、5. 8S、28S rDNA 亞單位的ITS 為非編碼區(qū)。編碼區(qū)序列相對保守, 而ITS 在兩代之間進化很快, 常發(fā)生變異, 在同一屬種間甚或種內可有不同程度的差異, 所以rDNA ITS 序列具有菌種分類鑒定的意義。
3分子生物學方法的研究現(xiàn)狀
DNA 指紋分型技術可以做到準確分類鑒定病原但主要用于流行病分型研究。近來將RFLP、PCR與雜交技術結合起來,對PCR產物進行RFLP分析可彌補單純RFLP分析時結果模糊之缺陷。Asticcioli等用RAPD方法證實在一新生兒重癥監(jiān)護病房中爆發(fā)流行的深部念珠菌病為兩株白色念珠菌所致。電泳核型是把整個染色體包埋在瓊脂糖凝膠中, 依賴染色體的大小和立體結構, 通過在凝膠中遷移的速度把基因組分離成染色體帶。Shin等在36d內從15位光滑念珠菌血癥患者血中分離出得到41 株光滑念株菌, 用PFGE技術發(fā)現(xiàn)同一患者血中連續(xù)分離得到的光滑念珠核型在迅速地發(fā)生變化并證實光滑念珠菌對唑類藥物耐藥性的獲得與使用該類藥物治療所致誘導耐藥相關。各種改良的PCR技術可以簡便、快速地鑒定多種醫(yī)學重要真菌。(1) 巢式PCR (nested PCR):使用巢式引物進行多輪擴增可提高特異性和靈敏度。Margit等用巢式PCR方法檢測深部感染煙曲霉的動物模型, 檢測下限達1CFU/ml。Hummel等用相同方法檢測了疑似腦曲霉病的6 位血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者的腦脊液, PCR結果臨床癥狀有良好的相關性。在巢式PCR 研究中要特別避免出現(xiàn)假陽性, 環(huán)境中存在著大量曲霉孢子很容易對樣本和試劑造成污染應通過嚴格實驗室檢測規(guī)范以及設置對照來控制。(2) 多重(mult ip lex PCR ) : Carvalho 等用一對通用引物結合八個種特異引物擴增ITS125. 8sRNA－ITS2片斷, 可同時鑒定出8種念珠菌, 精確度可達2 CFU/ml, 可在5h內得到結果。Giorgio等利用多重PCR方法直接檢測口腔念珠菌患者的口腔清洗液標本, 可以鑒定10種念珠菌, 且將檢測時間也短至5h。(3) 實時定量PCR: 精確地定量出測樣品中的基因數(shù)量, 利于PCR質量控制標準的建立。Vo llmer 等依據(jù)28SrDNA 基因的部分序列設計廣譜引物用實時定量PCR 來檢測可將對人致病的重要真菌鑒定到屬, 包括曲霉屬, 假絲酵母菌屬, 毛霉屬, 隱球菌屬等。他們用這種方法檢測了呼吸機支持通氣的重癥監(jiān)護患者的76 份氣管抽吸物標本和患有感染性心內膜炎的患者的70 份瓣膜組織標本。臨床上通過組織病理學檢查很難將接合菌與其他絲狀真菌鑒別, 但使用熒光定量PCR 技術, 根據(jù)接合菌高度保守的細胞色素b 基因序列來設計特異引物和雜交針探可以鑒定出檢測新鮮組織樣品中小克銀漢霉屬、毛霉屬、根霉菌屬等五種接合菌, 敏感性和特異性均為100%。
