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M1：TCS處理前甲基化產(chǎn)物;U1：處理前非甲基化產(chǎn)物;M2：80 mg/L TCS處理后甲基化產(chǎn)物;U2：80 mg/L TCS處理后非甲基化產(chǎn)物;N：水對(duì)照;PM：甲基化對(duì)照;PU：非甲基化對(duì)照
3 討論
TCS為247個(gè)氨基酸殘基組成的單一多肽鏈， TCS屬于RNA N-糖苷酶型，專一水解核糖體28S rRNA第4324位腺苷酸的N-C糖苷鍵，從而引起核糖體某些區(qū)域構(gòu)象的改變，影響核糖體的生物學(xué)功能，從而發(fā)揮腫瘤抑制作用[3]。TCS對(duì)HeLa細(xì)胞增殖有明顯抑制作用，呈量效關(guān)系。TCS濃度與HeLa細(xì)胞增殖抑制率存在線性回歸關(guān)系(P<0.01)，TCS 160 mg/L作用72 h抑制率最大，為79.79%。
一個(gè)細(xì)胞周期包括有絲分裂期(M)和分裂間期(G1、S、G2)，調(diào)控關(guān)鍵在分裂間期。TCS作用HeLa細(xì)胞48 h后，隨TCS濃度增大，S期細(xì)胞百分比對(duì)照組明顯增加(P<0.01)，G2/M期細(xì)胞明顯減少(P<0.05)。提示HeLa細(xì)胞阻滯于S期,不能順利地進(jìn)入G2/M期。細(xì)胞的DNA不能在S期得到準(zhǔn)確的復(fù)制，從而影響細(xì)胞增殖。細(xì)胞周期的進(jìn)行由不同的周期蛋白(Cyclins)所調(diào)控。TCS作用于何種周期蛋白及其作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。
細(xì)胞增殖失控和凋亡受阻是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的主要原因,抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是腫瘤治療的重要手段之一。TCS能誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡，且TCS濃度與凋亡率之間存在量效關(guān)系。有研究表明，天花粉蛋白具有核酸內(nèi)切酶功能，能夠切割細(xì)胞DNA超螺旋結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞損傷[4]。另外，TCS可能通過與受體結(jié)合,引起細(xì)胞內(nèi)信號(hào)途徑的激活或抑制,從而啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào),導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[5]醫(yī).學(xué)全.在.線網(wǎng)站m.zxtf.net.cn。
最近研究直接分析了基因啟動(dòng)子的CpG島甲基化，并與雜合性丟失或突變分析相結(jié)合, 證實(shí)啟動(dòng)子高甲基化是抑癌基因失活的第三種機(jī)制，并且在某些情況下是抑癌基因失活的唯一機(jī)制[6-7]。甲基化的核苷酸序列并未改變,僅通過個(gè)別堿基的修飾影響基因轉(zhuǎn)錄,且甲基化過程是可以逆轉(zhuǎn)的。APC基因是Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路中重要的抑癌基因，該基因啟動(dòng)子甲基化引起的基因表達(dá)缺失可導(dǎo)致Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路的異常從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。APC基因啟動(dòng)子高甲基化及基因轉(zhuǎn)錄缺失已見于結(jié)、直腸癌、食道癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、子宮內(nèi)膜癌、T淋巴細(xì)胞瘤等腫瘤[2]。本課題組以往研究發(fā)現(xiàn)APC基因啟動(dòng)子高甲基化在宮頸癌組織標(biāo)本DNA中為頻發(fā)事件(95例宮頸癌標(biāo)本陽性率為56.8%)，在宮頸癌各階段均有發(fā)生，且APC甲基化陽性率隨腫塊增大及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移而增高[8]。逆轉(zhuǎn)APC基因啟動(dòng)子高甲基化狀態(tài)，從而使APC基因轉(zhuǎn)錄激活，恢復(fù)APC基因表達(dá)，可能為宮頸治療提供新的途徑。本研究發(fā)現(xiàn)，TCS處理前，HeLa細(xì)胞APC基因啟動(dòng)子處于半甲基化狀態(tài)，即MSP檢測(cè)APC基因啟動(dòng)子甲基化產(chǎn)物及非甲基化產(chǎn)物均為陽性。20、40 mg/LTCS處理細(xì)胞48 h后甲基化狀態(tài)未改變。80 mg/L TCS處理HeLa細(xì)胞48 h后，處于半甲基化狀態(tài)的APC基因啟動(dòng)子出現(xiàn)了去甲基化(圖1)。APC基因啟動(dòng)子甲基化可導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄失活而致APC mRNA和APC蛋白表達(dá)缺失。當(dāng)APC蛋白缺失,則不能和β-catenin結(jié)合,累積的β-catenin轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核和Tcf4結(jié)合成復(fù)合體,啟動(dòng)增殖相關(guān)基因(如C-MYC)轉(zhuǎn)錄,最終導(dǎo)致細(xì)胞生長失控[9]。而APC基因啟動(dòng)子去甲基化可恢復(fù)HeLa細(xì)胞中APC基因表達(dá)，并恢復(fù)HeLa細(xì)胞膜上β-catenin的表達(dá)[10]。TCS誘導(dǎo)APC基因啟動(dòng)子去甲基化作用可能為TCS抑制HeLa細(xì)胞增殖的作用機(jī)制之一。王艷華等[11]發(fā)現(xiàn)TCS 對(duì)HeLa細(xì)胞中啟動(dòng)子發(fā)生子甲基化失活的TSLC1(Tumor suppressor in lung cancer1) 基因也有去甲基化作用。TCS去甲基化作用為其抗宮頸癌作用提供了新的機(jī)制，也為TCS抗宮頸癌臨床應(yīng)用提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
現(xiàn)今最常用的甲基化抑制劑為5-氮雜-2′-脫氧胞苷等胞苷類似物,由于較強(qiáng)致突變性臨床應(yīng)用受限。TCS作為引產(chǎn)藥已應(yīng)用于臨床，在抗絨癌方面研究也相當(dāng)廣泛，其副作用較一般化療藥明顯為小。TCS具有抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖的作用，可抑制細(xì)胞周期，誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡及APC基因去甲基化，有良好的臨床應(yīng)用前景。其早日應(yīng)用于臨床抗宮頸癌治療，將為宮頸癌患者康復(fù)帶來新的希望。
