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公開(公告)號(hào)
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CN1277921C
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公開(公告)日
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2006.10.04
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申請(qǐng)(專利)號(hào)
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CN200510048963.X
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申請(qǐng)日期
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2005.01.13
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專利名稱
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利用基因工程技術(shù)在家蠶體內(nèi)生產(chǎn)重組人乳鐵蛋白的方法
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主分類號(hào)
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C12N15/09(2006.01)I
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分類號(hào)
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C12N15/09(2006.01)I;C12N15/10(2006.01)I;C12N15/12(2006.01)I;C12N15/866(2006.01)I;C12P21/02(2006.01)I;C07K1/14(2006.01)I
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分案原申請(qǐng)?zhí)? |
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優(yōu)先權(quán)
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申請(qǐng)(專利權(quán))人
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浙江大學(xué)
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發(fā)明(設(shè)計(jì))人
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吳小鋒;姚慧鵬;曹翠平
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地址
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310027浙江省杭州市西湖區(qū)浙大路38號(hào)
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頒證日
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國(guó)際申請(qǐng)
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進(jìn)入國(guó)家日期
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專利代理機(jī)構(gòu)
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杭州求是專利事務(wù)所有限公司
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代理人
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林懷禹
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國(guó)省代碼
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浙江;33
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主權(quán)項(xiàng)
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利用基因工程技術(shù)在家蠶體內(nèi)生產(chǎn)重組人乳鐵蛋白的方法，其特征在于： (1)人乳鐵蛋白基因的克�。阂匀巳橄俳M織cDNA為模板，PCR基因擴(kuò)增技術(shù)獲得人乳鐵蛋白基因，引物設(shè)計(jì)如下：正向引物：5′GGATCCATGAAACTTGTCTTCCTC-3′，含有BamHI酶切位點(diǎn)；反向引物：5′-GGATCCTTACTTCCTGAGGAATTC-3′，含有BamHI酶切位點(diǎn)；PCR反應(yīng)的循環(huán)數(shù)、溫度和時(shí)間的設(shè)計(jì)如下：一個(gè)循環(huán)，94℃模板變性50秒；30個(gè)循環(huán)，55℃退火30秒，70℃延伸2分鐘；最后1個(gè)循環(huán)，70℃延伸10分鐘；利用1％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行PCR產(chǎn)物分析，并用PCR純化試劑盒純化，獲得全長(zhǎng)為2136bp的人乳鐵蛋白基因，隨后將人乳鐵蛋白基因克隆入3.9kb載體pCR2.1，獲得pCR2.1-LF，利用雙脫氧鏈終止法在核苷酸測(cè)序儀上測(cè)序確認(rèn)克隆人乳鐵蛋白基因順序正確性； (2)含有人乳鐵蛋白基因的重組桿狀病毒的構(gòu)建：用限制性內(nèi)切酶BamHI消化pCR2.1-LF得到人乳鐵蛋白基因片段，然后克隆入桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pBlueBacHisa獲得重組體pBlueBacHisa-LF；通過(guò)共轉(zhuǎn)染在昆蟲細(xì)胞內(nèi)與構(gòu)建的雜交桿狀病毒HyNPVDNA發(fā)生同源重組產(chǎn)生重組病毒，共轉(zhuǎn)染的方法為：1μgpBlueBacHisa-LFDNA和15μgHyNPVDNA混合，并加入14μl脂質(zhì)體lipofectin，最后加入滅菌蒸餾水至終體積40μl；將該混合液在室溫培育15分鐘后共轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Sf21培養(yǎng)細(xì)胞，先用無(wú)血清的TC-100培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)后，換成含有10％胎牛血清的新鮮培養(yǎng)基，27℃培養(yǎng)5天，收集培養(yǎng)基上清作為病毒原液，用來(lái)篩選重組病毒；重組病毒通過(guò)3輪空斑篩選，最終獲得高濃度純化的病毒溶液，濃度為108pfu/ml，將此重組病毒命名為HyNPV-LF； (3)家蠶體內(nèi)表達(dá)和重組人乳鐵蛋白純化：使用家蠶幼蟲5齡起蠶，接種上述重組病毒HyNPV-LF進(jìn)行感染表達(dá)；接種前，將幼蟲浸在冰水浴中麻醉10分鐘，注射用病毒懸浮液濃度為106pfu/ml，采用皮下注射的方法，每條家蠶注射20μl，注射1小時(shí)后給桑，在23-25℃下飼養(yǎng)；感染后的三天內(nèi)，看不到明顯的癥狀，到第四天，幼蟲開始食欲減弱，漸漸地呈現(xiàn)出感染癥狀；感染后第五天或第六天，感染的幼蟲大部分死亡，在此之前收集家蠶幼蟲；將幼蟲的血淋巴作為重組人乳鐵蛋白純化的起始材料，使用以下方法收集血淋巴：在15ml收集管的上方，將幼蟲向背面彎曲，用一只手固定幼蟲的頭部和尾部，讓腹部和腹足伸向外邊；用石蠟?zāi)っ芊獾?5號(hào)針頭刺破腹足收集血液，讓血液直接滴進(jìn)收集管中，為了防止血液氧化變黑，預(yù)先加入1/10體積的10mmol/L二硫蘇糖醇DTT，使其終濃度為1mmol/L； 從感染的幼蟲收集的血淋巴用非變性結(jié)合緩沖液進(jìn)行稀釋，所述非變性緩沖液為：Na3PO450mmol/L，NaCl0.5mol/L，pH8.0；樣品隨后結(jié)合于Ni-NTA柱，最后，重組蛋白用含有250mmol/L咪唑的非變性洗脫緩沖液洗脫，通過(guò)SDS-PAGE考馬斯亮藍(lán)染色后鑒定重組蛋白，結(jié)果表明獲得的重組人乳鐵蛋白非常純一，從每頭家蠶獲得的產(chǎn)量為400μg。
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摘要
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本發(fā)明公開了一種利用基因工程技術(shù)在家蠶體內(nèi)生產(chǎn)重組人乳鐵蛋白的方法。利用申請(qǐng)人構(gòu)建的AcNPV和BmNPV的雜交桿狀病毒HyNPV作為載體，構(gòu)建了含有人乳鐵蛋白基因的重組病毒。利用家蠶作為重組病毒的宿主，表達(dá)、生產(chǎn)了重組人乳鐵蛋白。解決了人乳鐵蛋白在大腸桿菌中表達(dá)需要復(fù)雜的復(fù)性操作、酵母表達(dá)中質(zhì)粒轉(zhuǎn)化體不穩(wěn)定和在哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)的成本太高的缺點(diǎn)。家蠶幼蟲體內(nèi)表達(dá)的重組人乳鐵蛋白大部分分泌在家蠶血淋巴中，非常有利于蛋白質(zhì)的快速提取，利用親和層析法純化了重組的人乳鐵蛋白，從每頭家蠶獲得的產(chǎn)量高達(dá)400μg。利用基因工程技術(shù)用家蠶作為表達(dá)載體可以大量生產(chǎn)重組人乳鐵蛋白，為它在醫(yī)學(xué)和治療領(lǐng)域上的應(yīng)用開辟了廣闊的前景。
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國(guó)際公布
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