| 公開(公告)號 | CN1810983A |
| 公開(公告)日 | 2006.08.02 |
| 申請(專利)號 | CN200510013155.X |
| 申請日期 | 2005.01.28 |
| 專利名稱 | 乳腺癌轉移中參與細胞黏附作用基因的分離及分離方法 |
| 主分類號 | C12P19/34(2006.01)I |
| 分類號 | C12P19/34(2006.01)I;C12Q1/68(2006.01)I;C12N5/06(2006.01)I;C07H21/04(2006.01)I |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權 | |
| 申請(專利權)人 | 南開大學 |
| 發(fā)明(設計)人 | 張曉東;葉麗虹;喬 玲;尤嘉琮 |
| 地址 | 300071天津市衛(wèi)津路94號 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進入國家日期 | |
| 專利代理機構 | 天津市學苑有限責任專利代理事務所 |
| 代理人 | 鄭 楠 |
| 國省代碼 | 天津;12 |
| 主權項 | 一種乳腺癌轉移中參與細胞黏附作用基因的分離方法，其特征在于包括： 1)用SCID(Severecombinedimmunodeficiency，SCID)鼠從人乳腺癌細胞系MCF-7中篩選和建立具有高轉移傾向的轉移亞克隆LM-MCF-7細胞系； 2)細胞培養(yǎng) 將LM-MCF-7和MCF-7細胞用RPMI1640(含有10％FBS、100u/ml硫酸鏈霉素和100u/ml青霉素)培養(yǎng)液，在37℃、5％CO2條件下CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； 3)總RNA提取 一步法提取MCF-7和LM-MCF-7細胞的總RNA，用異丙醇沉淀，并過柱純化； 4)cDNA反轉錄及熒光標記 取一定量總RNA，以T7-Oligo(dT)15為引物，合成雙鏈cDNA，純化；之后將雙鏈cDNA進行體外轉錄合成cRNA、純化；取cRNA，用SuperscriptII反轉錄酶(200u/μl)，9個堿基的隨機序列寡核苷酸引物反轉錄為cDNA并純化；取cDNA，用9個堿基的隨機序列寡核苷酸引物和KLENOW酶進行熒光標記，之后純化并抽干；標記過程中dATP，dGTP，dTTP使用濃度為120μM，dCTP為60μM，Cy5-dCTP，Cy3-dCTP為40μM，dNTP為10mM； 5)制備人寡聚核苷酸標準基因芯片 將Qiagen公司人類基因的Oligo庫中的寡聚DNA點制在一張75×25mm、經過化學修飾的載玻片上；點制在芯片上的樣品還包括人的12個看家基因作為陽性對照，12條人工合成的與人基因沒有同源性的70個堿基的寡聚DNA作為陰性對照，以及擬南芥的3個基因作為外標；整個點陣分成48個亞陣；每個亞陣有22行，22列；點間距為185μm，點的直徑約為140μm； 6)雜交與洗滌 將標記的DNA溶于35μl雜交液中，放入標準基因芯片于42℃雜交過夜；雜交結束后，將芯片在42℃含有02％SDS和2×SSC的液體中洗5分鐘，再在0.2×SSC中室溫洗5分鐘，最后甩干用于掃描； 雜交液的組分為：3×SSC，02％SDS，5×Denhart’s，25％甲酰胺； 7)篩選確定 用ScanArrayExpress雙通道激光掃描儀掃描基因芯片，用GenePixPro4.0軟件分析芯片上每個點Cy3和Cy5熒光信號的強度和比值，并用Lowess方法歸一化；以差異為兩倍(即比值大于2.0，小于0.5)的標準來確定差異表達基因。 |
| 摘要 | 本發(fā)明公開了一種高精確度、高通量篩選在乳腺癌轉移中參與細胞黏附作用基因的分離方法。本發(fā)明方法通過建立具有高轉移傾向的轉移亞克隆LM-MCF-7細胞系與其親本人乳腺癌細胞系MCF-7形成配對細胞系作為實驗樣本，不僅可隨時無限量培養(yǎng)獲得，且由于實驗樣本的細胞成分均一，保證了分離結果的精確性和準確性。本發(fā)明方法還通過基因表達譜芯片技術分離出了這些參與細胞黏附作用的基因，這些基因的表達和功能的確認，在乳腺癌藥物或基因治療方面以及在用于制備腫瘤轉移芯片、制備抗腫瘤轉移基因疫苗及建立抗腫瘤轉移藥物篩選技術平臺方面，都將有著重要的實際應用價值。 |
| 國際公布 |
