結締組織生長因子C區(qū)抗原的制備方法

醫(yī)藥數(shù)據(jù)庫中心藥學論壇

公開(公告)號	CN1238512C
公開(公告)日	2006.01.25
申請(專利)號	CN200310112672.3
申請日期	2003.12.18
專利名稱	結締組織生長因子C區(qū)抗原的制備方法
主分類號	C12N15/63(2006.01)I
分類號	C12N15/63(2006.01)I;C12N15/70(2006.01)I
分案原申請?zhí)?
優(yōu)先權
申請(專利權)人	東南大學
發(fā)明(設計)人	劉乃豐;吳國球
地址	210096江蘇省南京市四牌樓2號
頒證日
國際申請
進入國家日期
專利代理機構	南京經(jīng)緯專利商標代理有限公司
代理人	王之梓
國省代碼	江蘇;32
主權項	一種結締組織生長因子C區(qū)抗原的制備方法，其特征在于第一步：用NheI和XbaI酶對pCOMB3載體進行雙酶切，切除兩酶切位點NheI和XbaI之間的272bp條帶后的載體用T4DNA連接酶自連后轉化大腸桿菌JM109，然后，以質粒pET-28(a)+作模板，分別以p1：5’-GGCTCGAGGCCAACTCTAGTATGGCCC-3’及p2：5’-GGACTAGTCTAACCAGCACTTCAGTGGGAA-3’為上、下游引物，PCR擴增后，可見550bp條帶的擴增產(chǎn)物，回收該條帶，并將回收的條帶與被切除272bp后的pCOMB3載體連接，經(jīng)轉化JM109后篩選得到陽性質粒pKM；第二步：用組織貼壁法進行人內(nèi)皮細胞原代培養(yǎng)，用50mmol/L葡萄糖修飾的牛血清白蛋白對原代培養(yǎng)后的內(nèi)皮細胞干預8h，0.125％胰蛋白酶消化后，用Trizol法提取RNA，用逆轉錄試劑盒合成cDNA，在1.5ml管中依次加入：雙蒸H2O31.5μl，10×Taqbuffer5μl，10mol/LdNTP1μl，濃度為25pmol/μl的引物p3：5’CCCGGATCCGAAGCGGACCTAGAG-3’1μl，p4：5’-CCCAAGCTTTGCCATGTCTCCGTG-3’1μl，濃度為0.65μg/μl的cDNA模板10μl，濃度為5U/μl的TaqPlus聚合酶0.5μl，置于PCR儀擴增，擴增條件：94℃5min變性，94℃1min，65℃30sec，72℃1min，35個循環(huán)，72℃延伸10min，4℃保溫，再用SpeI和XhoI酶對PCR產(chǎn)物與陽性質粒pKM分別進行雙酶切后，用T4DNA連接酶使兩個片段通過粘性末端相連，轉化大腸桿菌JM109，從中獲得陽性質粒pKMc1；第三步：將含陽性質粒pKMc1的大腸桿菌JM109單菌落擴增后，用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷37℃誘導3h，得到含有結締組織生長因子C區(qū)242-349位氨基酸的大腸桿菌，超聲破碎細胞，用鎳離子樹脂親和層析獲得結締組織生長因子抗原。
摘要	結締組織生長因子抗原的制備方法，對pCOMB3載體雙酶切，切除272bp條帶后的載體用T4 DNA連接酶自連后轉化大腸桿菌，以pET-28(a)⁺作模板擴增，回收550bp條帶，將其與切除后的pCOMB₃載體連接，經(jīng)轉化后篩選得陽性質粒；對人內(nèi)皮細胞原代培養(yǎng)，用牛血清白蛋白對其干預8h，胰蛋白酶消化，用Trizol法提取RNA，合成cDNA，在1.5ml管中加入：ddH₂O 31.5μl，10×Taqbuffr5μl，10mol/L dNTP 1μl，25pmol/μl的引物，0.65μg/μl的cDNA模板10μ1，5U/μl的TaqPlus0.5μl，94℃5min變性，94℃1min，65℃30sec，72℃1min，35個循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃保溫下擴增，對PCR產(chǎn)物與陽性質粒雙酶切后，用T4DNA連接酶相連兩個片段，轉化大腸桿菌JM109，得pKMc1；將pKMc1的大腸桿菌單菌落擴增，用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷37℃誘導3 h，得大腸桿菌，超聲破碎，層析得結締組織生長因子抗原。
國際公布