| 公開(公告)號 | CN1712547A |
| 公開(公告)日 | 2005.12.28 |
| 申請(專利)號 | CN200510037778.0 |
| 申請日期 | 2005.02.01 |
| 專利名稱 | 甲胎蛋白(AFP)mRNA熒光定量RT-PCR檢測試劑盒 |
| 主分類號 | C12Q1/68 |
| 分類號 | C12Q1/68;C12Q1/25 |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(專利權(quán))人 | 合肥中科大生物技術(shù)有限公司 |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人 | 魏海明;田志剛;程 民;王宗貴 |
| 地址 | 230027安徽省合肥市金寨路96號科大西區(qū)生命科學(xué)學(xué)院 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進(jìn)入國家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | 合肥華信專利商標(biāo)事務(wù)所 |
| 代理人 | 余成俊 |
| 國省代碼 | 安徽;34 |
| 主權(quán)項(xiàng) | 甲胎蛋白(AFP)mRNA熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，其特征為：它包含細(xì)胞裂解液I、細(xì)胞裂解液II、RNA洗滌緩沖液I、RNA洗滌緩沖液II、無RNA酶的水、RNA分離柱、反轉(zhuǎn)錄緩沖液、dNTP混合物、逆轉(zhuǎn)錄酶儲存液、PCR反應(yīng)液、探針、標(biāo)準(zhǔn)品、對照品；以上各種溶液所用溶劑均為水；(1)、細(xì)胞裂解液I包含0.1mol/LTris-HCl(三羥甲基氨基甲烷-鹽酸，pH7.6，25℃)、0.1mol/L氯化鈉、0.05mol/L氯化鎂、水；(2)、細(xì)胞裂解液II包含3mol/L異硫氰酸胍、2mol/L鹽酸胍、0.3mol/L醋酸鈉(pH5.2)、0.2％(W/V)SDS(十二烷基硫酸鈉)、水；(3)、RNA洗滌緩沖液I包含0.2mol/L醋酸鈉(pH5.2)、0.1mol/L氯酸鈉、0.1mol/LTris-HCl(pH7.5，25℃)、水；(4)、RNA洗滌緩沖液II包含1.2mol/L檸檬酸鈉、0.5mol/LTris-HCl(pH7.5，25℃)、水；(5)、無RNA酶的水制備方法為：向去離子水加入DEPC(焦碳酸二乙酯)，至終濃度為0.05％(V/V)，室溫(22-25℃)放置10-12小時后，121℃，20min高壓，室溫放置備用。(6)、RNA分離柱是一種硅膠柱，可以特異性結(jié)合RNA，并可用水洗脫RNA，達(dá)到分離純化RNA的目的；(7)、反轉(zhuǎn)錄緩沖液包含9.1μmol/LOligo(dT)12-18、3.6U/μlRnaseInhibitor、72.7mmol/LDTT(二硫蘇糖醇)、182mmol/LTris-HCl(pH8.3，25℃)、273mmol/LKCl、1lmmol/LMgCl2、水；(8)、逆轉(zhuǎn)錄酶儲存液包含20mmol/LTris-HCl(pH7.5，25℃)、100mmol/LNaCl、0.1mmol/LEDTA、1.0mmol/LDTT、50％(V/V)甘油、0.01％(V/V)Nonidetp-40、200U/μl逆轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)、水；(9)、dNTP混合物包含dATP、dCTP、dGTP、dTTP，為其鈉鹽-水溶液，pH7.0-7.5，四種dNTP濃度均為10mmol/L；(10)、PCR反應(yīng)液包含18.5mmol/LTris-HCI(pH8.3，25℃)、2.78mmol/LMgCI2、92.6mmol/LKCl、上下游引物(0.37μmol/L)、0.1U/μlTaq酶、dNTP混合物(dATP，dCTP，dGTP，dTTP，其濃度均為400nmol/L)、水；上下游引物序列分別為：P1：5’-TGACTCCAGTAAACCCTGGT-3’P2：5’-AGAAATCTGCAATGACAGCC-3’(11)、探針為熒光標(biāo)記探針，其序列為：5’-FAM-TGCTGCACTTCTTCATATGCCAACA-TAMRA-3’探針的濃度為：2μmol/L，TE(10mmol/LTris-HCl，1mmol/LEDTA，水)溶解；(12)、標(biāo)準(zhǔn)品的序列為：1AGAAATCTGCAATGACAGCCTCAAGTTGTTCCTCTGTTATTTGTGGCTTT51TGCTTCACAAGGTTAATGAGAAACTCTTGCTTCATCGTTTGCAGCGCTAC101ACCCTGAGCTTGGCACAGATCCTTATGGAAAATGAACTTGTCATCAGAGA151ATGCAGGAGGGACATATGTTTCATCCACCACCAAGCTGCTGAAGCATGGC201CTCCTGTTGGCATATGAAGAAGTGCAGCACTGGCCAACACCAGGGTTTAC251TGGAGTCA標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為：106copies/μl，TE(10mmol/LTris-HCl，1mmol/LEDTA，水)溶解；(13)、對照品分為陽性對照品與陰性對照品，陽性對照品為有AFPcDNA的樣品(104copies/μl，TE溶解)，陰性對照品為正常人外周血總RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。 |
| 摘要 | 本發(fā)明涉及一種甲胎蛋白(AFP)mRNA熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，該試劑盒包含總RNA提取液(細(xì)胞裂解液I、細(xì)胞裂解液II、RNA洗滌緩沖液I、RNA洗滌緩沖液II和無RNA酶的水)，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，dNTP混合物，逆轉(zhuǎn)錄酶，PCR反應(yīng)液，探針，陽性標(biāo)準(zhǔn)品，對照品。本發(fā)明通過對新鮮抗凝外周血提取總RNA，并通過逆轉(zhuǎn)錄mRNA樣品得到cDNA，再結(jié)合實(shí)時熒光定量PCR檢測技術(shù)，可準(zhǔn)確定量檢測標(biāo)本中AFP的mRNA的表達(dá)量。本發(fā)明所提供的試劑盒可用于臨床及科研中檢測腫瘤患者的外周血、骨髓、淋巴結(jié)及癌組織中AFP mRNA的表達(dá)，為原發(fā)性肝癌的早期診斷、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、治療方案的確定及預(yù)后的判斷提供重要的參考依據(jù)。 |
| 國際公布 |
