| 公開(公告)號 | CN1683413A |
| 公開(公告)日 | 2005.10.19 |
| 申請(專利)號 | CN200510038083.4 |
| 申請日期 | 2005.03.11 |
| 專利名稱 | 基因工程法制備抗乙肝病毒特異性轉(zhuǎn)移因子的方法 |
| 主分類號 | C07K16/10 |
| 分類號 | C07K16/10;C12N15/09 |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(專利權(quán))人 | 揚州同人生物工程有限公司 |
| 發(fā)明(設(shè)計)人 | 葉滿紅;郭金鋼 |
| 地址 | 225100江蘇省揚州市邗江區(qū)楊廟鎮(zhèn)東首 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進入國家日期 | |
| 專利代理機構(gòu) | 揚州市錦江專利事務(wù)所 |
| 代理人 | 江平 |
| 國省代碼 | 江蘇;32 |
| 主權(quán)項 | 基因工程法制備抗乙肝病毒特異性轉(zhuǎn)移因子的方法，其特征在于包括以下步驟：一、mRNA差異顯示法克隆小鼠抗乙肝病毒特異性轉(zhuǎn)移因子基因取健康成年雌性BALBc小鼠，人工感染乙肝病毒，感染成功后，取出其脾臟組織，用DEPC處理的生理鹽水沖洗后迅速投入液氮中，待冷凍完全即可用于提取脾臟組織mRNA；脾臟組織總RNA的提取采用PromegaRNAgents總RNA提取系統(tǒng)，取脾臟組織于變性劑中使組織勻漿化，用酸平衡的苯酚∶氯仿∶異戊醇＝125∶24∶1進行抽提，使RNA脫離DNA及蛋白，從混合液中層析到水相，再用異丙醇將RNA沉淀濃縮；所得RNA用1-2個單位的無RNA酶污染的DNA酶處理，然后60-70℃加熱8-12分鐘，使DNA酶失活，mRNA溶解于雙蒸水中，零下65-75℃保存；采用PromegaPolyATtract-mRNA提取系統(tǒng)進行mRNA的抽提，在分離用磁架的作用下，雜交復(fù)合物被抗生鏈霉素蛋白包裹磁珠捕捉，隨后洗去非結(jié)合的RNA，使mRNA和核糖體RNA分離；再利用AMV反轉(zhuǎn)錄酶將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA第1條鏈，反轉(zhuǎn)錄以3’端的單堿基錨定引物引導(dǎo)下進行；然后以聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離擴增條帶，銀染法顯示差異表達mRNA，在PCR過程中3’端錨定引物和5’端隨機引物與反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物共同在低溫下退火，所得產(chǎn)物經(jīng)6％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，篩選特異性mRNA目的條帶；將特異性mRNA條帶進一步擴增、鑒定、雜交后克隆、測序、篩選；二、重組基因工程酵母菌的構(gòu)建對篩選所得的小鼠抗乙肝病毒特異性轉(zhuǎn)移因子基因進行質(zhì)粒構(gòu)建：通過PCR方法使小鼠抗乙肝病毒特異性轉(zhuǎn)移因子基因中帶有XhoI和XbaI酶切位點序列，再克隆到表達載體pPICZ中；將重組表達載體克隆進入啤酒酵母菌中，培養(yǎng)重組酵母菌30-40小時后，0.5％甲醇誘導(dǎo)40-45小時大規(guī)模表達抗乙肝病毒特異性轉(zhuǎn)移因子；三、基因工程表達產(chǎn)物的分離與純化提取抗乙肝病毒特異性轉(zhuǎn)移因子的細胞；將細胞破碎，分離，去除固體物質(zhì)，留上清，再純化即可獲得抗乙肝病毒特異性轉(zhuǎn)移因子。 |
| 摘要 | 本發(fā)明公開了一種以基因工程法制備抗乙肝病毒特異性轉(zhuǎn)移因子的方法，首先以mRNA差異顯示法克隆小鼠抗乙肝病毒特異性轉(zhuǎn)移因子基因；然后構(gòu)建表達抗乙肝病毒特異性轉(zhuǎn)移因子的重組酵母菌，并培養(yǎng)，大規(guī)模表達抗乙肝病毒特異性轉(zhuǎn)移因子，經(jīng)破碎、分離和純化即可獲得抗乙肝病毒特異性轉(zhuǎn)移因子。本發(fā)明可進行大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)，其生產(chǎn)成本低，產(chǎn)量大，可制成抗乙肝病毒的藥品和保健品等。 |
| 國際公布 |
