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篩選轉(zhuǎn)基因動(dòng)物細(xì)胞陽(yáng)性單克隆方法

公開(kāi)(公告)號(hào) CN1616653A  
公開(kāi)(公告)日 2005.05.18  
申請(qǐng)(專利)號(hào) CN200410092831.2  
申請(qǐng)日期 2004.11.12  
專利名稱 篩選轉(zhuǎn)基因動(dòng)物細(xì)胞陽(yáng)性單克隆方法  
主分類號(hào) C12N5/10  
分類號(hào) C12N5/10;C12Q1/04  
分案原申請(qǐng)?zhí)?  
優(yōu)先權(quán) 2004.9.20 CN 200410083047.5  
申請(qǐng)(專利權(quán))人 新疆金牛生物股份有限公司  
發(fā)明(設(shè)計(jì))人 王亮;朱海;呂自力;劉婷婷;帥志強(qiáng);彭濤  
地址 830026新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊市經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)校院路15號(hào)金牛公司科學(xué)院  
頒證日  
國(guó)際申請(qǐng)  
進(jìn)入國(guó)家日期  
專利代理機(jī)構(gòu) 烏魯木齊合縱專利事務(wù)所  
代理人 湯建武  
國(guó)省代碼 新疆;65  
主權(quán)項(xiàng) 一種篩選轉(zhuǎn)基因動(dòng)物細(xì)胞陽(yáng)性單克隆方法,其特征在于按下述步驟進(jìn)行:第一步,在培養(yǎng)液中對(duì)需要轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),待其動(dòng)物細(xì)胞聚合至40%至80%后,進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染;第二步,在基因轉(zhuǎn)染后進(jìn)行1天至7天的動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)恢復(fù),然后用能致死非基因轉(zhuǎn)染動(dòng)物細(xì)胞的濃度的新霉素進(jìn)行5天至20天篩選;第三步,在第二步致死性篩選后,使用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物細(xì)胞維持生長(zhǎng)濃度的新霉素,再加入離心收集的該動(dòng)物細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期含有生長(zhǎng)因子培養(yǎng)液,在此條件下,在培養(yǎng)液中進(jìn)行2天至14天的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增;第四步,當(dāng)?shù)谌街械年?yáng)性轉(zhuǎn)基因動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)形成克隆后,用細(xì)胞刮刀刮除正常細(xì)胞,保留轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性動(dòng)物細(xì)胞克;第五步,挑選和標(biāo)記選定的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物細(xì)胞陽(yáng)性單克隆,用0.125%至0.25%胰酶或EDTA-胰酶定點(diǎn)消化該單克隆細(xì)胞并將消化后的陽(yáng)性單克隆細(xì)胞迅速置入新的培養(yǎng)器皿中培養(yǎng)擴(kuò)增,培養(yǎng)擴(kuò)增至50%--80%的細(xì)胞聚合,用0.125%至0.25%濃度的胰酶或EDTA-胰酶消化和懸浮上述所培養(yǎng)擴(kuò)增的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因單克隆動(dòng)物細(xì)胞,加入培養(yǎng)液和致死非基因轉(zhuǎn)染動(dòng)物細(xì)胞的濃度的新霉素,繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞,在致死非基因轉(zhuǎn)染動(dòng)物細(xì)胞的濃度的新霉素和胰酶或EDTA-胰酶作用下,在培養(yǎng)液中致死殘留的非基因轉(zhuǎn)染動(dòng)物細(xì)胞;第六步,將第五步所得到陽(yáng)性單克隆動(dòng)物細(xì)胞再植入新的培養(yǎng)器皿中培養(yǎng),在陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因動(dòng)物細(xì)胞維持生長(zhǎng)的濃度的新霉素條件下,再加入離心收集的該細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期含有生長(zhǎng)因子培養(yǎng)液的條件下,即可得到大量的純化的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性單克隆動(dòng)物細(xì)胞。  
摘要 一種篩選轉(zhuǎn)基因動(dòng)物細(xì)胞陽(yáng)性單克隆方法,其按下述步驟進(jìn)行:第一步,對(duì)需要轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),并進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染;第二步,用能致死非基因轉(zhuǎn)染動(dòng)物細(xì)胞的濃度的新霉素進(jìn)行篩選;第三步,轉(zhuǎn)基因動(dòng)物細(xì)胞陽(yáng)性克隆的培養(yǎng)擴(kuò)增;第四步,刮除非基因轉(zhuǎn)染動(dòng)物細(xì)胞,保留轉(zhuǎn)基因動(dòng)物細(xì)胞陽(yáng)性克;第五步,挑選轉(zhuǎn)基因動(dòng)物細(xì)胞陽(yáng)性單克隆并培養(yǎng)擴(kuò)增,致死殘留的非基因轉(zhuǎn)染動(dòng)物細(xì)胞;第六步,進(jìn)一步培養(yǎng)擴(kuò)增得到大量的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物陽(yáng)性單克隆細(xì)胞。本發(fā)明的特點(diǎn):省時(shí)省工,效率高,并且大大降低了篩選轉(zhuǎn)基因動(dòng)物細(xì)胞陽(yáng)性單克隆的成本。同時(shí)該方法適用于商業(yè)上具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物細(xì)胞陽(yáng)性單克隆的篩選,是制作轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的必要手段之一。  
國(guó)際公布  
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