奶牛新孢子蟲病
新孢子蟲�。∟eosporiasis)是由犬新孢子蟲 （ Neospora caninum Dubey，1988)寄生于犬、牛、羊等多種動物細(xì)胞內(nèi)而引起的一種原蟲病。該病1984 年由挪威獸醫(yī)學(xué)家Jcerkas在患腦炎和肌炎的幼犬 體內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)，1988年Dubey博士將其命名為犬新孢子蟲［1］。犬新孢了蟲的終末宿主是犬［2］，牛、羊、犬、馬、鹿、小鼠等均可作為中間宿主。雖然新孢子蟲病是多種家畜共患的一種原蟲病，但其對牛的危害尤為嚴(yán)重，主要造成母牛流產(chǎn)、產(chǎn)死胎以及新生兒的運動神經(jīng)系統(tǒng)疾病，同時該病可垂直傳播，帶蟲母�？蓪⑾x體直接傳給新生犢牛，已證實它是造成奶牛工業(yè)嚴(yán)重經(jīng)濟損失的一個重要原因。由于我國每年從歐美及周邊國家引進(jìn)大量種牛或商品牛，很可能將本病帶入我國。本病防制的關(guān)鍵在于診斷，為此作者就近年國外學(xué)者奶牛新孢子蟲病診斷方法進(jìn)行了綜述，供同行們參考。以下介紹的是奶牛疾病防治：
1 臨床診斷
生前診斷主要依靠臨床癥狀觀察。本病一年四季均可發(fā)生，但高峰多出現(xiàn)在夏季，感染在母畜間不存在年齡差異，以妊娠6個月以前流產(chǎn)的胎兒血清 陽性比例較高，引起的流產(chǎn)常呈散發(fā)性或地方性流行，因此當(dāng)出現(xiàn)母畜流產(chǎn)，死產(chǎn)，新生兒癱瘓、畸形，共濟失調(diào)，肌肉萎縮，抽搐或其它運動神經(jīng)系統(tǒng)疾病 癥狀時，特別是一群或多群出現(xiàn)此類癥狀時應(yīng)懷疑是否為新孢子蟲感染［3，4］ 。
2 病原學(xué)診斷
2.1 病理組織學(xué)檢查
根據(jù) N.caninum 的寄生部位，在新生兒的肌肉、腦組織、呼吸道分泌物及皮膚膿包等活組織中均能檢查到 N.caninum 。應(yīng)采集流產(chǎn)胎兒的腦、脊髓、心臟及肝等組織進(jìn)行常規(guī)組織學(xué)檢查。可見多灶性、非化膿性腦炎、神經(jīng)炎、心肌炎、骨骼肌炎、肝炎以及細(xì)胞浸潤等，但要確診，必須檢測到 N.caninum 速殖子和（或)組織包囊［5］ 。
2.2 病原的分離培養(yǎng)
為了分離及培養(yǎng) N.cani-num 病原，可采集待檢動物病料組織，勻漿后皮下接種小鼠、大鼠、小沙鼠、犬、貓、家兔等。接種劑量依 據(jù)動物種類不同而不同。發(fā)病后采集中樞神經(jīng)或內(nèi)臟組織進(jìn)行特異性檢驗，也可進(jìn)行傳代接種。 N. caninum 的體外培養(yǎng)已獲成功，可在牛腎細(xì)胞、Vero細(xì)胞等傳代細(xì)胞系中生長發(fā)育，常用牛單核細(xì)胞和牛心肺主動脈內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。Davison等［6］ （1997)將約10 g新鮮的死胎犢牛腦組織用0.5%的胰蛋白酶勻漿消化后接種到6份Vero細(xì)胞上。在 含有5%CO2、95%空氣混合物的RPMI-1640培養(yǎng)液中，于37°C 下維持培養(yǎng)。接種后29天在一份培養(yǎng) 液中首次觀察到典型的 N.caninum 速殖子。Ya- mane等［7］（1997)采集16頭流產(chǎn)胎兒和疑似新孢子 蟲病犢牛組織樣本，接種于牛心肺主動脈內(nèi)皮細(xì)胞和猴腎細(xì)胞培養(yǎng)物中，接種后49天在一份細(xì)胞中觀 察到 N.caninum 速殖子。這表明病原的分離和體外培養(yǎng)可用于新孢子蟲病的特異性診斷。
2.3 免疫組織化學(xué)檢查蟲體
采集病死動物的大腦、脊髓，或肝、腎、胎盤，或其它病變部位，切片后用免疫組織化學(xué)染色。犬 N.caninum 血清可使蟲體特 異性著染，而弓形蟲和其它原蟲血清則不能，可進(jìn)行特異性診斷 ［1，8］�？股锼氐鞍�-生物素-過氧化物酶染色法（ABPC法)就是其中的一種，Lindsay用兔抗 N.caninum 血清對組織切片進(jìn)行染色，可檢測 到新孢子蟲速殖子和緩殖子。而對龔地弓形蟲、哈 氏哈芒球蟲、枯氏肉孢子蟲、杰利氏貝諾孢子蟲等不著染，同時兔抗龔地弓形蟲血清對 N.caninum 無反應(yīng) ［1］ 。
3 血清學(xué)診斷
有效的血清學(xué)檢測對于牛流產(chǎn)的準(zhǔn)確診斷、新孢子蟲病傳播的流行病學(xué)調(diào)查以及 N.caninum 其它中間和終末宿主的確定是十分必要的。目前，檢測牛 N.caninum 抗體的許多種血清學(xué)方法已得到報道，包括間接熒光抗體試驗（IFAT)、Western blot試驗、凝集試驗以及ELISA檢測方法等。其中IFAT 和ELISA方法應(yīng)用廣泛，且檢測結(jié)果的特異性和敏 感性都較高［9，10］。
3.1 間接熒光抗體試驗（IFAT)
將Vero細(xì)胞傳代細(xì)胞系培養(yǎng)的 N.caninum 固定在載玻片上，用IF-AT測定血清和初乳中抗 N.caninum IgG的抗體效價，血清中IFAT抗體效價為1200～11600，甚至高達(dá)16400。另外，也可檢查患畜腦脊髓液中的抗體，本法尤其適用于犢牛先天性 N.caninum 感染。本法特異性較強，敏感性較高，檢測動物血清抗體時血清稀釋100倍后不與龔地弓形蟲發(fā)生交叉反應(yīng)［2，9，11］ 。Okeoma，Williamson對269份自然感染N.caninum的牛血清樣本進(jìn)行了不同抗體滴度的IFAT檢測，結(jié)果表明盡管抗體滴度存在著波動，但I(xiàn)FAT滴度相同的組中 N.caninum 速殖子抗原的染色體條帶形式仍然相同，此法可用于識別 N.cani- num 速殖子抗原［12］。
3.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA)
現(xiàn)有研究中ELISA檢測法主要建立在整體或部分純化的自然性N.aninum 抗原或重組的 N.canmum 抗原，或 N.can- inum 抗體活性以及 N.caninum特異性競爭抑制性單克隆抗體（MAbs)的基礎(chǔ)之上。目前，已研制出了有效的ELISA診斷試劑盒。其中建立在 N.caninum 單克隆抗體（MAb)和表面抗原基礎(chǔ)上的ELISA檢 測方法的應(yīng)用廣泛，而且診斷的特異性和敏感性都 較高［9，10，13］。
3.2.1 ELISA目前，已研制出了有效的 N.caninum
ELISA診斷試劑盒。Williams［14］等學(xué)者對ELISA試劑盒檢測牛血清 N.cqninum 抗體的效果進(jìn)行了估測，并與IFAT的檢測結(jié)果進(jìn)行了比較。依試劑盒說明進(jìn)行檢驗，檢測結(jié)果小于20pp的樣本為陰性，在20～25pp范圍內(nèi)為可疑，大于25pp的為陽性樣本［pp為檢測樣本的OD值與陽性對照血清（IFAT 效價為15120)平均OD值的百分比］。結(jié)果表明，該法與IFAT檢測結(jié)果有較高一致性，并且更為可 靠，特異，敏感。另外，也可應(yīng)用ELISA方法檢測牛乳中 N.caninum 抗體，Schares G，Barwald A等人應(yīng)用ELISA檢測牛乳中新孢子蟲抗體，指出稀釋比12的牛乳可得到與相應(yīng)血清檢測呈線性相關(guān)的實驗結(jié)果［15］。臨床試驗結(jié)果表明，Biovet ELISA試劑盒和IDEXX ELISA試劑盒的特異性和敏感性都大于95%，可作為檢測牛 N.caninum 抗體的有效方法［14］ 。
3.2.2 MAb-cELISA Baszler等［16］
（1999)人在原有研究基礎(chǔ)上，對以單克隆抗體（MAb 4A4-2)為基礎(chǔ)的競爭抑制性酶聯(lián)免疫吸附試驗（cELISA)進(jìn)行了改良。改良后的cELISA方法應(yīng)用特異性單克隆抗體（5B6-25存在于弗氏完全佐劑中)來俘獲自然性N.caninum 抗原，并使之與競爭性單克隆抗體（MAb 4A4-2)直接結(jié)合，這兩種單克隆抗體可 以結(jié)合在不同的抗原表位上而得到保存，它們都主導(dǎo)免疫65-Kda N.caninum 速殖子表面抗原（Nc- 1分離株)。cELISA 方法可以減少非特異性抗體結(jié)合，而且允許應(yīng)用未稀釋的待檢血清以提高診斷的特異性和敏感性。實驗結(jié)果中診斷敏感性為97.6%，診斷特異性為98.6% ，表明該法對 N.caninum陽性與陰性樣本具有敏銳的識別力。 N.caninum cELISA的特異性取決于MAb 4A4-2，且它可以與抗原直接結(jié)合，因此對cELISA的改良以及類似于凝集實驗等其它輔助性檢驗是沒有必要的。 cELISA是一種檢測牛 N.caninum 抗體的快速，靈敏，準(zhǔn)確的方法 ［9，13，17］。
3.2.3 以 N.caninum 表面抗原為基礎(chǔ)的ELISA
N.caninum 表面存在許多抗原，N.caninum 主要表面 抗原可作為新孢子蟲病的一個重要診斷劑。 NcSAG1是 N.caninum 一個主要表面抗原，Cha-han 等人將編碼缺少信號肽和C末端疏水功能區(qū)的 NcSAG1（NcSAGlt)的基因克隆，并通過與谷光甘肽-S轉(zhuǎn)移酶（GST)一起作為融合蛋白而使之在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)。將純化的GST-NcSAG1t應(yīng)用到ELISA中以檢測牛新孢子蟲抗體。該法可對IFAT 檢測呈陽性和陰性的牛血清進(jìn)行明顯的區(qū)分，而且它不會產(chǎn)生與實驗性感染龔地弓形蟲小鼠的交叉反 應(yīng)［18］。Howe和Tang ［19］（2002)對 N.eaninum 主要表面抗原rNcp29進(jìn)行了研究，并設(shè)計了rNcp29r ELISA以檢測牛血清中特異性抗體，Ncp29由與龔地弓形蟲特異性SAGl基因同源的基因來編碼，是 一種重組的表面蛋白，實驗結(jié)果表明該法可以很快區(qū)分 N.caninum 血清反應(yīng)陽性的牛群（［OD］大于1.2，稀釋度為1500或更高)和陰性對照組（［OD］小于0.5，稀釋度為1500)。另外，從龔地弓形蟲或 枯氏肉孢子蟲的動物體分離的血清ELISA檢測結(jié) 果為陰性，因此rNcp29r ELIhttp://m.zxtf.net.cn/shouyi/ya/jiage/SA對于檢測 N.caninum抗體具有高度的特異性和敏感性。Hye-Jin AHN和Sera KIM等（2003)對另一個 N.caninum 表面抗原Ncp43 （ N.caninum Korean株)進(jìn)行了研究，其抗原表位位于該分子C末端的23 處（Son et al.，2001)，將純化的GST與Ncp43 C末端的23處（P片段)進(jìn)行融合（可應(yīng)用一個相對較短的缺少特征性標(biāo)記的6xHis替代GST)，并將其作為抗原設(shè)計ELISA試驗。結(jié)果表明該法能夠準(zhǔn)確 的檢測出特異性 N.caninum 抗體，而且Ncp43與龔地弓形蟲的TgSAGlA一起可用于不同哺乳動物的 N.caninum 和龔地弓形蟲感染的鑒別診斷 ［20，21］。另外，其它幾種重組的 N.caninum 抗原如Nc4.1 和Nc14.1 也可作為重組蛋白進(jìn)行ELISA試驗 以檢驗特異性 N.caninum 抗體［19］ 。
4 分子生物學(xué)診斷
目前，奶牛 N.caninum 病分子生物學(xué)診斷方法
中應(yīng)用較多的主要是多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)。此法多以 N.caninum 特異性表面抗原為基礎(chǔ)，適用于感 染細(xì)胞培養(yǎng)基中的病原和福爾馬林固定、石蠟包埋 的組織中 N.caninum 病原的檢測。
4.1 Indirectly in situ PCR
此法是Loschen-ber- ger等（2004)研究的檢測 N.caninum 的一種新方法，它具有高度的特異性和敏感性，能替代免疫組化方法，可通過半抗原標(biāo)記的核苷PRINS反應(yīng)檢測到，也可通過熒光染色體標(biāo)記的抗體顯示出來［22］。
4.2 檢測Nc-5基因的PCR
Paula等（2004)從12頭2歲的妊娠5個月流產(chǎn)牛胎的臨床樣本中采集血液并分離DNA，應(yīng)用Np21+和Np6+引物對對N.caninum NC-5基因的350bp片段進(jìn)行PCR擴增，同時應(yīng)用Tim3和Tim11引物對對內(nèi)轉(zhuǎn)錄阻斷物1 （ITSI)進(jìn)行擴增。證明此法效果很好［23］。Fernandez和Mora（2002)設(shè)計了一個二次PCR 法以定量檢測牛流產(chǎn)胎兒中的 N.caninum ，他們設(shè)計寡聚核苷酸引物以擴增 N.caninum Nc-5序列的76bp DNA片段的相應(yīng)基因。結(jié)果表明這種PCR方法可用于新孢子蟲病的定量檢測［24］。另外，Müller 和Vonlaufen（2002)設(shè)計了二次熒光PCR試驗以定量檢測鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織切片中的新孢子蟲，這 種應(yīng)用雙重?zé)晒怆s交技術(shù)的PCR可有效的檢測腦組織中的新孢子蟲［25］ 。
4.3 單管套式PCR（single tube nested PCR)
El-lis，McMillan等［26］（1999)描述了一種檢測新孢子蟲的具有兩個連續(xù)步驟的單管套式PCR技術(shù)（single tube nested PCR)這種PCR診斷法對于靶序列的特異性復(fù)制產(chǎn)物特別敏感，可從分離于自然感染的牛及犬的福爾馬林固定、石蠟包埋的組織樣本中擴增 N.caninum DNA，達(dá)到臨床診斷的目的。并對PCR MIMIC也做了描述，有待于更深入的研究以證實此 項技術(shù)對于研究 N.caninum 生物學(xué)特性中的作用。
5 結(jié)語
綜上所述，奶牛 N.caninum 病的診斷要結(jié)合臨床癥狀、流行病學(xué)、病理組織學(xué)變化的特點，應(yīng)用多 種檢測方法進(jìn)行綜合診斷。血清學(xué)檢測和PCR檢 測是診斷奶牛 N.caninum 病的有效方法。特異性PCR檢測以及建立在 N.caninum 特異性表面抗原和競爭抑制性單克隆抗體基礎(chǔ)上的ELISA方法，診斷的特異性和敏感性都很高，適用于感染細(xì)胞培養(yǎng)基中的病原和福爾馬林固定、石蠟包埋的組織中 N. caninum 病原的檢測。在實際工作中，我們要根據(jù)實際情況，選用相應(yīng)的方法診斷奶牛的新孢子蟲病。
