動脈粥樣硬化:第一節(jié)　DNA的克隆

以質(zhì)�；蚴删�體作載體進(jìn)行DNA克隆，在理論上是很簡捷的，即用一種限制酶切割質(zhì)粒DNA，然后在體外與外源，DNA（如干擾素基因，生長激素基因)相連接，再用所得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌如大腸桿菌，以鑒定重組DNA。

通常所用的質(zhì)粒載體有pBR322、pUC18、pUC19等，噬菌載體有M13噬菌體載體等。

圖24-1 質(zhì)粒載體的定向克隆

一、質(zhì)�；蚴删�體載體與外源DNA的連接反應(yīng)

外源DNA片段末端的性質(zhì)，以及質(zhì)粒載體和外源DNA上限制酶切位點(diǎn)的性質(zhì)決定了質(zhì)�；蚴删�體與外源DNA連接反應(yīng)的不同策略。

（一)外源DNA帶有非互補(bǔ)突出端的片段

用兩種不同的限制酶分別消化質(zhì)粒等載體和外源DNA，可以產(chǎn)生帶非互補(bǔ)突出端的片段，這是最容易連接的片段，如圖24-1所示。

將已經(jīng)連接外源DNA的細(xì)菌質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)的大腸桿菌，然后在含有AP等抗生素的平板上鑒定陽性重組體菌落，具體方法有：①檢查α互補(bǔ)能力的喪失情況；②對小量制備的質(zhì)粒DNA進(jìn)行限制酶切的分析；③核酸雜交。

（二)外源DNA帶有相同末端（平端或粘端)的片段

帶有相同末端（平端或粘端)的外源DNA片段必須克隆到具有匹配末端的線狀質(zhì)粒或噬菌體載體中，在連接反應(yīng)中，質(zhì)粒或噬菌體載體可能發(fā)生自身環(huán)化，也可能形成串聯(lián)寡聚物。因而，常常使用堿性磷酸酶去除5’磷酸基團(tuán)以抑制質(zhì)粒DNA的自身連接和環(huán)化。用細(xì)菌堿性磷酸酶（BAP)或牛小腸堿性磷酸酶（CIP)去除線狀DNA兩端的5’磷酸可以最大限度地減少質(zhì)粒DNA的自身環(huán)化。而具有5’末端磷酸的外源DNA片段可有效地與去磷酸化質(zhì)粒DNA相連接，產(chǎn)生一個含有兩個切口的開環(huán)分子。因?yàn)榄h(huán)化DNA（即使只帶切口的環(huán)狀DNA)的轉(zhuǎn)化效率比線狀DNA高得多，所以大多數(shù)轉(zhuǎn)化體都含有重組質(zhì)粒，如圖24-2所示。

圖24-2 利用磷酸酶防止載體DNA的重新環(huán)化

（三)外源DNA帶有平端的片段

外源DNA片段帶有平端的片段，平端的連接效率比帶有互補(bǔ)末端的DNA要低得多。因此，涉及平端分子的連接反應(yīng)所要求的T4噬菌體DNA連接酶的濃度和外源及質(zhì)粒DNA或噬菌體DNA的濃度都要高得多。

（四)連接反應(yīng)的體系

10×連接緩沖液1μl

10mMATp 1μl

質(zhì)�；蚴删�體DNa200ng～1μg

外源DNa 200ng～1μg

T4噬菌DNA連接酶0.5～2nuits

4-6℃溫育8～24h

連接反應(yīng)結(jié)束時，取1～5μl上述反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化200μl的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，即可將外源DNA與載體接連起來。

二、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化

細(xì)菌轉(zhuǎn)化的方法多以Mendel和Higa（1970)的發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)，其基本方法是用冰預(yù)冷的CaCl₂或多種2價陽離子等處理細(xì)菌，使之進(jìn)入感受態(tài)得以轉(zhuǎn)化。

用CaCl₂制備新鮮或冷凍的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，常用于成批制備感受態(tài)細(xì)菌。本法適用于大多數(shù)大腸桿菌菌株，且迅速、重復(fù)性好。操作過程簡述如下。

1．從37℃培m.zxtf.net.cn/job/養(yǎng)16～20h的新鮮平板中挑取一個單菌落（如大腸桿菌DH52)，或1ml新鮮的16～20h過夜培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)到一個含有100mlLB培養(yǎng)基的1L或500ml燒瓶中。于37℃劇烈振搖培養(yǎng)約2～3h（旋轉(zhuǎn)搖床200～300r/min)，每隔20～30min測量OD600值≈0.4。

2．在無菌條件下將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個，用冰預(yù)冷的50ml聚丙烯離心管中，在冰上放置10～20min。

3．于4℃用SorvallGS2轉(zhuǎn)頭（或與其離心管相配的轉(zhuǎn)頭)以4000r/min離心10min，以回收細(xì)胞。

4．倒數(shù)培養(yǎng)液，將管倒置1min以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡。

5．以10ml用冰預(yù)冷的0.1mMCaCl₂重懸每份沉淀，放于冰上。

6．于4℃用SorvallGS3轉(zhuǎn)頭（或與其相應(yīng)的轉(zhuǎn)頭)以4000r/min離心10min，以回收細(xì)胞。

7．倒出培養(yǎng)液，將管倒置1min以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡。

8．每50ml初始培養(yǎng)物用2ml冰預(yù)冷的0.1M CaCl₂重懸每份沉定，此時，可以迅速將細(xì)胞分裝成小份，液氮中冰凍，-70℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

9．用冷卻的無菌吸頭從每種感受態(tài)細(xì)胞懸液中各取200μl轉(zhuǎn)移到無菌的微量離心管中，每管加DNA或連接反應(yīng)混合物（體積≤10μl，DNA≤50ng)，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，在冰中放置30min。

10．將離心管放到預(yù)加溫到40℃的循環(huán)水浴中的試管架上，放置90s～2min，不要搖動試管。

11．快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻1～2min。

12．每離心管加800μlSOC培養(yǎng)基，用水浴將培養(yǎng)基加溫到37℃，然后將管轉(zhuǎn)移到37℃搖床上，溫育45min使細(xì)菌復(fù)蘇，并且表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性標(biāo)記基因。

13．將適當(dāng)體積（每個90mm平板可達(dá)200μl)已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含200mmol/l MgSO₄和相應(yīng)抗生素的SOB培養(yǎng)基上。

14．將平板置于室溫至液體被吸收。

15．倒置平皿，于37℃培養(yǎng)，12～16h后可出現(xiàn)菌落。

三、用M13噬菌體轉(zhuǎn)染感受態(tài)細(xì)胞

1．感受態(tài)細(xì)胞的制備

（1)用JM101或TG1等菌的培養(yǎng)菌液在M9基本培養(yǎng)基平板上的劃線培養(yǎng)，于37℃溫育24～36h。

（2)批量制備凍存的感受態(tài)細(xì)胞的方法，同大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備。

2.用M13噬菌體轉(zhuǎn)染感受態(tài)細(xì)胞

（1)用2×YT或SOB培養(yǎng)液于37℃持續(xù)地振搖，將用于鋪平板的細(xì)胞（JM101或TG1等)培養(yǎng)過夜。

（2)從-70℃以下冰箱中取出一份凍存的JM101或TGI感受態(tài)細(xì)菌，于室溫慢慢融化，立即放在冰上10min。

（3)于各感受態(tài)細(xì)胞管中，加入連接反應(yīng)液，應(yīng)同時做兩個對照，一個加5pgM13噬菌體雙鏈環(huán)狀DNA，另一個則完全沒有DNA。輕彈管外壁使其混勻，冰浴30min。

（4)取數(shù)支無菌培養(yǎng)管，分別加入3ml熔化的2×YT或SOB頂層瓊脂，置47℃以備步驟6使用。

（5)將裝有感受態(tài)細(xì)胞和DNA的培養(yǎng)管放入42℃水浴，溫育整整90s，立即將管放回冰浴之中，2min后各管加入1ml過夜培養(yǎng)的JM101或TG1等菌液，混勻。

（6)在步驟（4)準(zhǔn)備的裝有溶化的2×YT或SOB頂層瓊脂的管內(nèi)各加入40μlX-gal溶液（20mg/ml，溶于二甲基甲酰胺)和4μlIPTG溶液（200mg/ml)振蕩混勻，分別�。�5)中混合物各300μl加入各管，振蕩混勻，立即將管內(nèi)混合物傾入標(biāo)記好的LB瓊脂平板上，輕輕旋動平皿，以使細(xì)菌與頂層瓊脂分布均勻。

（7)蓋好平皿，于室溫放置5min，使頂層瓊脂凝固，將平板倒置于37℃培養(yǎng)。4個h后噬斑開始出現(xiàn)，8～12h后菌斑不再變化。野生型M13噬菌體形成的噬斑為深藍(lán)色，重組噬菌體則可形成無色噬斑。

四、含重組質(zhì)粒的細(xì)胞菌落的鑒定

含重組質(zhì)粒的細(xì)胞菌落常用的鑒定方法有：①小規(guī)模制備質(zhì)粒DNA進(jìn)行限制酶切分析；②α互補(bǔ)；③插入失活；④雜交篩選。下面簡要介紹小規(guī)模制備質(zhì)粒DNA進(jìn)行限制性酶切分析。小規(guī)模制備質(zhì)粒DNA可用天美等公司的Wizard Minipreps DNA試劑盒或采用下述方法：

1.挑取一些獨(dú)立的轉(zhuǎn)化菌落進(jìn)行小規(guī)模培養(yǎng)，用無菌牙簽或挑種環(huán)挑取單菌落于2ml含有相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃劇烈振搖下培養(yǎng)過夜。

2．將1.5ml培養(yǎng)物倒入微量離心管中，用微量離心機(jī)于4℃以12000g離心30s，將剩余的培養(yǎng)物貯存于4℃。

3．吸取培養(yǎng)液，使細(xì)菌沉淀盡可能干燥。

4．將細(xì)菌沉淀重懸于200μl溶液Ⅰ中，劇烈振蕩。

溶液Ⅰ 25mmol/L Tris·HCl（pH8.0)

10mmol/LEDTA（pH8.0)

溶液Ⅰ可成批配制，每瓶約100ml，高壓下101bf/m²（6.895×10⁴pa)蒸氣滅菌15min，貯存于4℃。

5．加200μl新配制的溶液Ⅱ。

溶液Ⅱ 0.2mol/L NaOH

1% SDS

蓋緊管口，快速顛倒離心管5次，以混合內(nèi)容物。應(yīng)確保離心管的整個表面均與溶液Ⅱ接觸。不要振蕩，將離心管放置于冰上。

6．加200μl溶液Ⅲ

溶液Ⅲ 5mol/l 乙酸甲 60ml

冰乙酸11.5ml

水28.5ml

蓋緊管口，將管倒置，溫和振蕩10min，使溶液Ⅲ在粘稠的細(xì)菌裂解物中分散均勻，之后將管置于冰上m.zxtf.net.cn/rencai/3～5min。

7．用微量離心管于4℃以12000g離心5min，將上清轉(zhuǎn)移另一離心管中。

8．加等量酚和氯仿，振蕩混勻，用微量離心機(jī)于4℃以12000g離心2min，將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。

9．用2倍體積的乙醇于室溫沉淀雙鏈DNA，振蕩混合，于室溫放置2min。

10．用微量離心機(jī)于4℃以12000g離心5min。

11．小心吸去上清液，將離管倒置于一張紙巾上，以使所有液體流出。再將附于管壁的液滴除盡。

12．用1ml70%乙醇于4℃洗滌雙鏈DNA沉淀，按步驟1所述方法去掉上清，在空氣中使核酸沉淀，干燥10min。

13．用50μl含無DNA酶的胰RNA酶（20μl/ml)的TE重新溶解核酸，振蕩，貯存于-20℃。

14．用適當(dāng)限制性內(nèi)切酶分析所得DNA。

五、M13噬菌體重組DNA分子導(dǎo)入大腸桿菌

1．感受態(tài)細(xì)胞的制備

（1)將1ml過夜培養(yǎng)的細(xì)菌（如DH52、TG1、TM101)接種于100ml2×YT培養(yǎng)于500ml燒瓶。于37℃刷烈振蕩，通常≥200rpm培養(yǎng)的細(xì)菌密度約OD550=0.2～0.5(5×10⁷cells/ml),需2～4h。

（2)將培養(yǎng)物放于冰上致冷10min，于4℃離心細(xì)菌培養(yǎng)物，10000rpm離心10min。

（3)棄除上清，將細(xì)菌懸浮于原始培養(yǎng)體積的一半（約50ml)的50mMCaCl2和10mmTris·HCl（pH8.0)無菌冷凍液體中。

（4)將細(xì)菌懸浮放在冰上約5min，然后將懸浮物于4℃10000/rpm離心10min。

（5)棄上清，懸浮細(xì)菌于原始培養(yǎng)體積的1/15的50mMCaCl和10mMTris·HCl（pH8.0)無菌冷凍中。此時的細(xì)胞是感受態(tài)細(xì)胞，即可用于轉(zhuǎn)化。200μl分裝于無菌的1.5ml微量離心管中，貯存于-80℃冰箱中。

2．轉(zhuǎn)化程序

（1)取出200μl感受態(tài)細(xì)胞慢慢使其溶化，并立即放于冰上，加入DNA或連接反應(yīng)混合物，DNA量通常≤50mg。用手指彈打試管10次，使之混勻，然后放在冰上40～45min。

（2)將管放于42℃水浴中2min。

（3)然后每管直接加入1.0ml2×YT培養(yǎng)基，倒置混勻，并于37℃培養(yǎng)8～12h，干浴或水浴，不需振搖。此期間使細(xì)菌生長并開始表達(dá)抗菌素。

（4)每200μl轉(zhuǎn)化混合物分別于6個2×YT瓊脂培養(yǎng)板上補(bǔ)充相應(yīng)抗生素，并含有X-gal（20mg/ml)、IPTG（200mg/ml)。

（5)鋪板使細(xì)菌混合物干后，倒轉(zhuǎn)平板放于30～37℃培養(yǎng)箱中18～22h�？寺≡诖似陂g應(yīng)該出現(xiàn)，否則轉(zhuǎn)化不成功。