動(dòng)脈粥樣硬化:第四節(jié)　血清脂蛋白非電泳定量法

一、高密度脂蛋白膽固醇測定

血漿中脂蛋白有多種，測定其各自的含量對(duì)于了解機(jī)體正常及疾病過程中脂質(zhì)代謝狀況有重要的臨床意義。HDL是一組不均一的脂蛋白顆粒，其膽固醇含量占血漿總膽固醇量的25%～35%。由于血漿中所有脂蛋白均含有膽固醇，因此，只有先分離出HDL才能對(duì)其進(jìn)行定量。分離HDL的方法中，沉淀法是目前臨床使用最多的方法，操作簡便快速。沉淀法原理是利用多聚陰離子和二價(jià)陽離子共同作用于脂蛋白，并選擇性地使含ApoB的VLDL和LDL脂蛋白沉淀，再測定含HDL的上清液膽固醇，即高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C)。定量HDL全量是很困難的，因?yàn)樗�是蛋白質(zhì)和脂類的混合物，故以測定HDL中所含膽固醇含量作為HDL定量依據(jù)。

要測定血清中HDL-C，就必需先沉淀HDL以外的脂蛋白，即VLDL和LDL。使血清中VLDL和LDL沉淀的試劑很多，常用的有四種：①肝素-錳沉淀法，該法操作簡便易行，一旦遇上血脂升高的標(biāo)本，有沉淀不完全的差異；②硫酸葡聚糖-鎂法，該法也簡單易行，試劑較貴而難買到；③聚乙二醇法，雖然簡便易行，若遇高脂血癥標(biāo)本，其重復(fù)性差；④磷鉬鎢酸-鎂法，操作簡便易行，結(jié)果準(zhǔn)確，是目前臨床推薦使用的方法；⑤另有一種不沉淀VLDL和LDL也可直接測定HDL的方法，稱之為直接測定法。其原理是，先用一種封阻血清VLDL和LDL，而不封阻HDL，當(dāng)測膽固醇的酶試劑加入后，酶可作用于HDL的膽固醇進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，測出其濃度，但酶試劑就無法使已被試劑封阻的VLDL和LDL的膽固醇進(jìn)行反應(yīng)，這種直接法操作更為簡便，無需離心等繁雜步驟，便于在自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行HDL-C測定，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，缺點(diǎn)是成本過高。下面僅介紹目前推薦使用的方法。

（一)原理

磷鎢酸-鎂（PTA-Mg²⁺)沉淀血清中含ApoB的脂蛋白（VLDL、LDL)，上清液中只含HDL，用酶法測定上清液中膽固醇，即HDL-C。

生成的醌亞胺與HDL中的CE及FC成正比。

2．試劑組成

（1)沉淀劑磷鎢酸鈉4g溶于50ml雙蒸水中，加入1mol/l NaoH16ml，充分?jǐn)嚢韬�，再加雙水至100ml，調(diào)pH到7.6。再取40ml此溶液，加2mol/l MgCl₂10ml，混勻，再加水至100ml，此為應(yīng)用液。

（2)膽固醇酶法測定試劑（同第十五章)

（3)膽固醇標(biāo)準(zhǔn)參考液（同第十五章)

3．操作

（1)空腹12h，抽取靜脈血，不抗凝，分離血清備測。于24h內(nèi)操作完畢。

（2)其他操作同前。

4．注意事項(xiàng)

（1)室溫以15～20℃為宜，＜15℃或＞30℃時(shí)應(yīng)增加或減少靜置時(shí)間，離心轉(zhuǎn)速要恒定一致。

（2)離心沉淀后，要立即吸出上清進(jìn)行測定，否則結(jié)果偏離不準(zhǔn)。

（3)若血清TC超過500mg/dl時(shí)，上清液會(huì)出現(xiàn)混濁，表明有部分膽蛋白漂浮在上清液中未沉淀完全，此時(shí)將血清稀釋重新沉淀，其所測值乘以稀釋倍數(shù)。

（二)血清HDL-C選擇遮敝直接測定法。

1．原理

含反應(yīng)抑制劑的陰離子表面活性劑加入血清中后，與CM、VLDL和LDL緊密結(jié)合，少量與HDL結(jié)合。爾后，再加入反應(yīng)促進(jìn)劑的聚陰離子表面活性劑后，HDL溶化并釋放出膽固醇，與膽固醇測定試劑進(jìn)行反應(yīng)，達(dá)到僅測出高密度脂蛋白-膽固醇（HDL-C)的目的，其反應(yīng)全過程為：

2．試劑（第一化學(xué))

RⅠ：前處理液（第一反應(yīng)液)

RⅡ：第二反應(yīng)液（可溶性表面活性劑)及顯色液

HDL-C參考血清

3．操作

按雙試劑雙波長法在CL-7200型全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行檢測，有關(guān)參數(shù)如表16-1所示。

表16-1 HDL-C檢測參數(shù)

標(biāo)本濃度按△A=A₂-A₁的吸光度計(jì)算

4．特點(diǎn)

（1)直接測定，無需預(yù)處理。

（2)操作簡便，減少影響準(zhǔn)確性的因素。

（3)標(biāo)本及試劑用量少，準(zhǔn)確性高。

（4)抗干擾能力強(qiáng)，適合于自動(dòng)化分析。

（5)該法CV為5%以下，回收率90%～110%。線性范圍（0～5.85mmol/L)。

5．注意事項(xiàng)

（1)待測血清標(biāo)本于當(dāng)日測試，2～8℃保存，一周內(nèi)測定，-20℃長期保存，對(duì)測定結(jié)果無影響。

（2)干擾物維生素C500mg/L、膽紅素200mg/L、Hb5.0g/L以下均不影響測定結(jié)果。

二、血清低密度脂蛋白測定

LDL是一組不均一的脂蛋白顆粒，其膽固醇含量約占總膽固醇的45%～50%。

測定血漿中LDL，首先同樣要分離LDL，其分離方法有超速離心法、聚陰離子沉淀法、色譜法、電泳法及計(jì)算法等。以聚陰離子沉淀法簡便易于操作，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。由于直接測定LDL有一定的困難，因?yàn)樗�是蛋白質(zhì)脂類組成的顆狀結(jié)構(gòu)，膽固醇是其較為衡定的因素，因此采用測定LDL中所含的膽固醇的濃度作為LDL定量的依據(jù)。

另外，還可以通過用Friedwal公式計(jì)算，主要是利用血清TC、TG及HDL-C濃度測定結(jié)果，即LDL-C=TC-HDL-C-（1/5)TG。對(duì)脂代謝異常的高脂血癥，不能按此方法計(jì)算結(jié)果。

（一)聚乙烯硫酸鹽（PVS)法

1．原理

生成的醌亞胺與上清液的TC含量成正比。

2．試劑組成

（1)沉淀劑：聚乙烯硫酸鉀鹽0.7g/L、聚乙二醇獨(dú)甲醚170g/L、乙二胺四乙酸5mmol/L，混勻，4～21℃避光可保存一年。

（2)酶法膽固醇測定試劑（同第15章)。

（3)膽固醇標(biāo)準(zhǔn)液：2.58mmol/L。

3．操作

（1)空腹12h，采靜脈血，3h內(nèi)分離完成血清以免脂蛋白之間相互交換和防止LDL降解。-70℃可以保存數(shù)月之久。

（2)取200μl血清置于含有沉淀劑100μl試管中充分混勻，室溫放置15min,3000r/min離心，留上清測定膽固醇。

（3)按下表進(jìn)行操作：

混勻，37℃6min，以空白管調(diào)零（500nm)，讀取光密度。

（4)計(jì)算

血清LDL-C=TC-上清液膽固醇

（5)注意事項(xiàng)

標(biāo)本沉淀過程嚴(yán)格按要求進(jìn)行。吸取上清液時(shí)，注意輕吸，別攪動(dòng)沉淀。

PVS法能將Lp（α)完全沉淀，一般情況下，正常人含量極少，一旦高脂血癥、Lp（α)增高時(shí)，其測定值LDL-C應(yīng)為LDL-C和Lp（α)-C之和。

（二)血清LDL-C直接測定法

1．原理

含反應(yīng)活性劑的試劑Ⅰ加入血清后，與HDL、VLDL和CM反應(yīng)，使其膽固醇水解并與酶反應(yīng)生成無色產(chǎn)物溶于介質(zhì)中。再加入含溶解LDL的活性劑Ⅱ試劑，使LDL水解并與其中的膽固醇試劑進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)生成紅色化合物，定量血清中LDL-C。

以△A=A₂-A₁進(jìn)行運(yùn)算，測出LDL-C的含量

2．試劑（第一化學(xué))

R1：去垢劑1、COD、POD、4-AAP。

R2：去垢劑2、DSBmT。

3．操作

按CL-7200型或其他型號(hào)全自動(dòng)生化分析儀檢測，有關(guān)參數(shù)如表16-2所示。

表16-2　LDL-C檢測參數(shù)

4．特點(diǎn)

（1)直接測定，無需預(yù)先處理。

（2)操作簡便，減少影響準(zhǔn)確性的因素。

（3)標(biāo)本及試劑用量少，準(zhǔn)確性高。

（4)抗干擾能力強(qiáng)，適合于自動(dòng)化分析。

（5)該法CV為5%以下，回收率90%～110%，線性范圍0～88mmol/L。

5．注意事項(xiàng)

待測血清標(biāo)本于當(dāng)日測試，2～8℃一周內(nèi)保存，-20℃以下長期保存，結(jié)果均不受影響。

三、高密度脂蛋白亞組份膽固醇（HDL2-C，HDL3-C)檢測

聚乙二醇20000沉淀法

1．原理：

HDL中主要組份為HDL₂和HDL₃。用聚乙二醇20000（PEG20000)作沉淀劑，以不同濃度在不同pH條件下，可將HDL₂和HDL₃分離開。95g/L聚乙二醇20000在pH6.5環(huán)境下可將血清中低密度脂蛋白（LDL)和極低密度脂蛋白（VLDL)沉淀，離心后上清液中只含HDL。170g/L聚乙二醇20000在pH7.5環(huán)境中，可將LDL、VLDL、HDL₂沉淀，離心后上清液中只含HDL₃，以酶試劑側(cè)定各自上清液中膽固醇含量，通過換算，計(jì)算出代表HDL各亞組分含量。

2．試劑：沉淀劑Ⅰ：95g/L PEGm.zxtf.net.cn/shiti/20000，pH6.5

沉淀劑Ⅱ：170g/LPEG20000，pH7.5。

膽固醇酶應(yīng)用液及參考血清以試劑盒而定。

3．操作方法：（以生化分析儀為例)按表16-3操作

表16-3 HDL-C亞組分測定操作步驟

置混勻器上混勻2min，置室溫10min，3000r/min離心20min，上清液待測。

上清液于生化分析儀測定，測定參數(shù)參照總固醇測定法。

5．結(jié)果計(jì)算

HDL-C=上機(jī)測得結(jié)果×血清稀釋倍數(shù)

HDL₃-C=上機(jī)測得結(jié)果×血清稀釋倍數(shù)

HDL₂-C=HDL-C×HDL3

6．注意事項(xiàng)：

離心時(shí)間及速度一定要準(zhǔn)確；

離心上清液混濁者應(yīng)繼續(xù)離心直到清亮止；

四、血清Lp（α)測定法

1．原理

血漿（清)中脂蛋白（α)（Lp（α))與Lp（α)的單克隆抗體（鼠)結(jié)合形成抗原抗體免疫復(fù)合物，有濁度改變，測定溶液界質(zhì)中混濁度的光密度改變，求其血漿中Lp（α)的含量。

Lp（α)+抗人Lp（α)→抗原抗體復(fù)合物→測定光密度

2．試劑與儀器

試劑（第一化學(xué))；Lp（α)緩沖液（R1)；Lp（α)抗體液（R2)。

儀器：生化分析儀（以CL-7200型為例)

3．操作方法

以△A=A₂-A₁進(jìn)行運(yùn)算Lp（α)濃度。

4．定標(biāo)：

取Lp（α)定值液，用0.9%NaCl液稀釋。

采用上述操作步驟，按免疫測定法定標(biāo)，其操作方法及標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖16-3所示。

圖16-3 Lp（α)免疫測定法的反應(yīng)過程光密度變化值mAbs（A)及其檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖（B)（CL-7200型)

上機(jī)參數(shù)（以CL-72OO型為例)

5．注意事項(xiàng)：

（1)操作時(shí)，標(biāo)本和試劑無需處理；

（2)血漿或血清標(biāo)本均可檢測。標(biāo)本置2～21℃保存1周不變；

（3)標(biāo)本濃度超過定標(biāo)最高值時(shí)，應(yīng)用生理水稀釋后再測；

（4)抗體試劑（R₁)避免反復(fù)接觸；

（5)測定時(shí)避免日光直接照射。

五、脂蛋白x的電泳分析

1．原理

血清脂蛋白x的組成中磷脂占66%，蛋白質(zhì)僅占6%，在電場中因電荷少，選擇電滲大小合適的瓊脂為電泳支持物，則LpX向陰極移動(dòng)，而其他蛋白質(zhì)向陰極移動(dòng)，從而達(dá)到分離的目的。用免疫沉淀法或聚陰離子沉淀法使其在瓊脂板上沉淀，對(duì)于LpX陽性的血清可以在加樣孔的陰極端見到白色沉淀帶。

2、試劑

巴比妥緩沖液500mmol/L：pH8.6,離子強(qiáng)度0.05。

1%瓊脂用上述巴比妥緩沖液加熱配制。

沉淀劑；每升中含MgCl₂0.1mol，肝素2.5g及MaCl9g。

3．儀器：電泳儀。

4．操作：

（1)制板 1%瓊脂糖加熱未冷卻前于一潔凈載玻片上均勻鋪開。凝固后在一端2cm～3cm處打孔（直徑約2.5mm)。

（2)電泳　將血清20μl加于小孔內(nèi)（勿使外溢和有氣泡)。按瓊脂糖脂蛋白電泳操作、搭橋、通電1mA、40min。

（3)漿瓊脂玻片浸在沉淀劑中30min后觀察結(jié)果（如Lp-x陽性，數(shù)min內(nèi)即出現(xiàn)沉淀線)，Lp-x濃度到3.3mg/dl上即可出現(xiàn)陽性反應(yīng)。

正常值：正常人血清無Lp-x帶。

（儲(chǔ)建中　吳翠華)