實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸:第二節(jié)　FCM在生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)方面的應(yīng)用

流式細(xì)胞術(shù)在細(xì)胞生物學(xué)、分子遺傳學(xué)、微生物學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)以及臨床腫瘤學(xué)、臨床血液學(xué)等諸多領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用。本節(jié)　概要介紹它們的技術(shù)途徑及主要原理，大家可以從中看出它們是和細(xì)胞化學(xué)密切相關(guān)的。

一、FCM應(yīng)用的技術(shù)途徑

FCM是通過測量細(xì)胞的多種參量來獲取信息的。細(xì)胞參數(shù)分為結(jié)構(gòu)參量和功能參量兩大類。結(jié)構(gòu)參量主要用于描述細(xì)胞的化學(xué)組分和形態(tài)特征；功能參量主要是描述細(xì)胞整體的理化和生物特性。這些參量有的需要經(jīng)熒光標(biāo)記方可測定，有的并不需要熒光標(biāo)記。DNA以及RNA的含量，蛋白總含量、胞內(nèi)pH值和細(xì)胞大小等為結(jié)構(gòu)參數(shù)；細(xì)胞周期動(dòng)力學(xué)、特殊配體的鑒定、特殊細(xì)胞的生物活性等則為功能參數(shù)。

1．DNA和RNA的測量和分析DNA和RNA的含量可以用多種熒光探針標(biāo)記后測出。對(duì)細(xì)胞內(nèi)DNA含量的測定可用于細(xì)胞生物學(xué)方面的研究和臨床腫瘤學(xué)的診斷；測量RNA的含量可用于血液中的網(wǎng)織紅細(xì)胞的檢測和計(jì)數(shù)；DNA和RNA含量的測定可以用于區(qū)別細(xì)胞周期中的G₀和G₁期。常用的熒光探針有吖啶橙（AO，Acridine·orange)、派洛寧Y（PY，Pyronine Y)、HO（Hoechst)系列和色霉素A₃（CA₃)等。利用HO/CA₃雙染色還可分析DNA的堿基組成。還可以結(jié)合Brdu (Bromodeoxyuridine, 溴脫氧尿嘧啶核苷)單克隆抗體免疫熒光來測定細(xì)胞內(nèi)DNA合成。

2．蛋白質(zhì)總量測定用FCM可以測定細(xì)胞中蛋白的總含量，以檢測一個(gè)細(xì)胞群體生長和代謝的狀態(tài)，或區(qū)別具有不同蛋白含量的細(xì)胞亞群，如血液中的白細(xì)胞的分類。檢測總蛋白的常用熒光探針為異硫氰基熒光素（FITC，F(xiàn)luorescein isothiocyanate)，F(xiàn)ITC以共價(jià)鍵方式與蛋白上帶正電的殘基結(jié)合。

3．特殊配體的測定配體是與不同的細(xì)胞結(jié)構(gòu)特異結(jié)合很強(qiáng)的各種大分子和小分子，通過對(duì)特異性的熒光標(biāo)記的配體的測定可以獲得不少有關(guān)結(jié)構(gòu)參量和功能參量的信息。例如用標(biāo)記的外源凝集素可檢測細(xì)胞表面糖；用標(biāo)記抗體可測表面抗原；用標(biāo)記多聚陽離子可檢測細(xì)胞表面電荷；用標(biāo)記的激素、生長因子、神經(jīng)遞質(zhì)和病毒等可檢測細(xì)胞受體；用標(biāo)記的大分子、微生物等可檢測細(xì)胞的內(nèi)吞性；用熒光素標(biāo)記的親和素以及帶有DUTP的生物素衍生物的DNA探針跟靶細(xì)胞的DNA雜交能夠檢測原位的特殊基因等。這方面的應(yīng)用范圍廣、有前途，已經(jīng)成為研究細(xì)胞和組織中的抗原、基因和各種生化過程的強(qiáng)有力的新技術(shù)。用于這方面工作的熒光探針主要有FITC、若丹明系列（如四甲基異硫氰基若丹明TRITC、異硫氰基若丹明X-RITc 和美國德州紅等)、藻膽蛋白系列等。由于各種熒光探針具有不同的光譜特性，在使用中要注意正確地使用激光光源和濾片。

4．生物活性的測定就生物流行性來說，主要包括兩方面工作：①細(xì)胞本身的死活；②活細(xì)胞生物功能發(fā)揮的強(qiáng)弱。前項(xiàng)工作單一，后項(xiàng)工作要復(fù)雜得多。FCM用來判斷細(xì)胞死活的常用熒光探針有二大類：一類是能透過活的細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)而發(fā)出熒光的物質(zhì)；例如下醋酸酯熒光素（FDA，flourescein Diacetate)它可被活細(xì)胞持留而發(fā)出黃綠色熒光；若細(xì)胞有損傷則會(huì)從細(xì)胞中流失，觀察不到熒光。另一類是不能透過活細(xì)胞膜，但能對(duì)固定的細(xì)胞及膜有破損的細(xì)胞的核進(jìn)行染色，例如碘化丙啶（PI,Propidium iodide)和溴化乙錠（EB,Ethidiumbromide )就是常用的第二類熒光探針。

用FCM來測定活細(xì)胞生物功能發(fā)揮方面和性能的指標(biāo)很多。例如可用來測細(xì)胞膜電位、細(xì)胞內(nèi)pH值和細(xì)胞內(nèi)鈣等，這些都和細(xì)胞的激活密切相關(guān)。FCM也可用來測膜結(jié)構(gòu)的流動(dòng)性或微粘度等。有報(bào)告可以用FCM代替⁵¹Cr的放射免疫分析來測定天然殺傷細(xì)胞（NK, Natu-ral killer cells)對(duì)靶細(xì)胞毒www.med126.com理學(xué)活性的大小。

二、FCM的典型應(yīng)用簡介

下面簡單介紹FCM在各個(gè)領(lǐng)域中應(yīng)用的典型實(shí)例，以求對(duì)FCM應(yīng)用的全面了解，并能深入了解FCM在免疫細(xì)胞化學(xué)中應(yīng)用的背景。

1．在細(xì)胞生物學(xué)方面的應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)是FCM應(yīng)用最廣泛也是最基本的領(lǐng)域，細(xì)胞周期分析是其基本分析內(nèi)容之一，而實(shí)施的技術(shù)途徑是通過測定細(xì)胞周期各時(shí)相的DNA含量來達(dá)到的。

眾所周知，細(xì)胞周期由G₁期、S期、G₂期和M期所構(gòu)成的。各期細(xì)胞的DNA含量如下：G₁期為2C，G₂期和M期為4C，S期則在2C到4C之間。所以在FCM的DNA直方圖上形成的譜線則為峰分布，而且G₁峰的道數(shù)恰好是G₂和M峰道數(shù)的一半（圖10-7)。研究表明：對(duì)于正常細(xì)胞群，各周期時(shí)相的細(xì)胞數(shù)的比例是同一的；對(duì)于惡性病變的細(xì)胞群則是非均一的（圖10-8)。

圖10-7　細(xì)胞周期的DNA直方圖

圖10-8　細(xì)胞周期中的細(xì)胞數(shù)目與腫瘤的關(guān)系

臨床腫瘤病學(xué)已經(jīng)注意到細(xì)胞動(dòng)力學(xué)的重要性。研究工作表明：腫瘤細(xì)胞對(duì)化療和放療的敏感程度與細(xì)胞的增生率高低密切相關(guān)；采取細(xì)胞同步化（Cell Synchronization)措施可以提高療效。例如可以使用雌激素這種外源性藥物讓雌激素受體陽性的乳腺癌細(xì)胞同步化。

臨床微生物學(xué)可以用FCM對(duì)大量細(xì)菌的DNA和RNA含量進(jìn)行測量，進(jìn)行微生物鑒定、醫(yī)學(xué)常規(guī)中的細(xì)菌抗生素敏感試驗(yàn)和傳染活性的測定。

FCM優(yōu)良的分析和分選功能在分子遺傳學(xué)領(lǐng)域也能充分發(fā)揮。例如流式細(xì)胞核型分析技術(shù)就是用FCM對(duì)染色體進(jìn)行分類、純化，檢測或定量測量細(xì)胞表面或內(nèi)部由特異基本所編碼的成份。這方面的成果已用在畜類性別的預(yù)選擇，以m.zxtf.net.cn/Article/及對(duì)人類計(jì)劃生育等方面的工作。

2．在免疫學(xué)方面的應(yīng)用　FCM以它的快速、靈活及定量的特點(diǎn)被廣泛地應(yīng)用于免疫學(xué)的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用的各個(gè)方面，尤其是結(jié)合單克隆抗體技術(shù)，在免疫分型、分選、腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)測、機(jī)體免疫狀態(tài)的監(jiān)測、免疫細(xì)胞的系統(tǒng)發(fā)生及特性研究等方面更能起到重要作用，成為現(xiàn)代免疫技術(shù)的重要組成部分�；�于免疫技術(shù)是免疫細(xì)胞化學(xué)分析技術(shù)的基礎(chǔ)，我們著重介紹FCM在免疫應(yīng)用中的技術(shù)問題。

（1)免疫應(yīng)用的激發(fā)光源和濾片系統(tǒng)：適用于免疫技術(shù)的FCM的激發(fā)光是氪離子氣體激光器，光譜中波長為531nm和856nm的譜線最強(qiáng)。為了擴(kuò)大儀器對(duì)雙標(biāo)記或三標(biāo)記染色的熒光信號(hào)的分辨范圍可使用雙激光光源。

為了減少細(xì)胞由于激光束造成的散射光對(duì)光電倍增管的影響，要使用貼有干涉膜的濾片系統(tǒng)。為了同時(shí)測定兩種波長以上的熒光信號(hào)，光路中還要使用二向性分光元件。

為了測定伴隨細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程所產(chǎn)生的早期免疫及生化性質(zhì)的改變，例如膜的流行性，DNA構(gòu)象變化等，可以使用偏振片。

總之，應(yīng)用于免疫學(xué)時(shí)要充分考慮有關(guān)光源及光學(xué)濾片系統(tǒng)的正確使用。

（2)免疫應(yīng)用的熒光染料及染色：免疫應(yīng)用中的熒光染料主要有FITC（488nm)、TRITC（515nm)、PE（藻紅蛋白，575nm)及其組合。在進(jìn)行多種標(biāo)記時(shí)特別要注意結(jié)合抗體的每種色素都不干擾抗體反應(yīng)的特異性，也不相互干擾。

免疫熒光染色有直接法和間接法二類：

①直接染色法

1)取約10⁶的細(xì)胞置于尖底離心管內(nèi)，管內(nèi)液體要少些。加熒光標(biāo)記抗體，在4℃溫度下靜置15～30min。若作雙標(biāo)記染色也可直接加入。

2)用冷的10%的小牛血清、0.1%的疊氮鈉溶液，1/15mol/L的PBS（pH4.4)離心清洗細(xì)胞2次。1000rpm離心5min或4000rpm離心1min。

3)加入適量緩沖液待測。

②間接染色法：

1)取10⁶細(xì)胞加特異的第一抗體，4^℃溫度下靜置15～30min。

2)加緩沖液離心清洗2次后，吸盡殘留液體，彈散沉淀，加入熒光標(biāo)記的第二抗體，4^℃靜置30　min。

3)緩沖液離心清洗2次后加入適量緩沖液待測。為減少無關(guān)因素干擾，操作盡量在水浴中進(jìn)行。

染色中應(yīng)注意的事項(xiàng)：①細(xì)胞標(biāo)本在整個(gè)過程中要盡量保持新鮮，采用有效措施防止表面抗原消失和細(xì)胞死亡；②熒光標(biāo)記物用前應(yīng)用濾膜或高速離心去除顆�；虺猎�以減少非特異性干擾；③細(xì)胞標(biāo)本染色前應(yīng)除死細(xì)胞；④為提高靈敏度可用三步間接染色法。

（3)免疫熒光標(biāo)本的特殊處理：

①死細(xì)胞及碎片去除：樣品中不可避免地存在著死細(xì)胞及碎片，影響分析結(jié)果。對(duì)于血細(xì)胞可用FCM通過0^。散射的差異不經(jīng)染色而將死細(xì)胞分出棄除；對(duì)于培養(yǎng)細(xì)胞，由于其大小分布不均，可在樣品內(nèi)加少量PI染色后將死細(xì)胞去掉。一般情況下即可用儀器直接去除碎片，也可用血清沉降法去除大碎片，用離法去除小碎片。

②標(biāo)本的保存和固定：實(shí)驗(yàn)中大多數(shù)樣品在染色或分析前需要保存一定的時(shí)間，有時(shí)甚至需要進(jìn)行固定。

未染色的新鮮標(biāo)本貯存方法如下：10%二甲基亞砜，90%小牛血清，5×10^6～1×10⁷細(xì)胞在-70^℃過夜，然后置液氮中可長期保存。

免疫染色未經(jīng)固定的標(biāo)本在4^℃可保存48h。若需存放時(shí)間較長、或標(biāo)本具有傳染性，應(yīng)該用固定劑固定。常用的固定劑配方是：1%～4%的多聚甲醛和PBS或0.8%的生理鹽水配成p H7.2的固定液；或用0.37%～1.5%甲醛和PBS配成p H7.4的固定液。固定方法是：將經(jīng)免疫熒光染色的細(xì)胞離心沉淀，再加入固定液混勻，放在4^℃溫度保存。一般來說，經(jīng)固定處理的標(biāo)本保存1周至2個(gè)月，多數(shù)樣品的陽性細(xì)胞群體比例及熒光強(qiáng)度增色能保持在正常范圍之內(nèi)。

（4)主要檢測的免疫指標(biāo)：

①細(xì)胞毒試驗(yàn)：細(xì)胞毒是機(jī)體的一種免疫監(jiān)督機(jī)制，細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)是一項(xiàng)重要的免疫指標(biāo)。例如天然殺傷細(xì)胞NK（Natural killer)是一種引起免疫媒介的效應(yīng)物，在抗腫瘤及感染因子的免疫監(jiān)督系統(tǒng)中起著重要作用。研究表明，對(duì)NK細(xì)胞的測量可以做為免疫治療監(jiān)測的重要參數(shù)和有效的預(yù)后征狀的指標(biāo)。所使用的熒光探針為CFDA（Caboxy-fluorescein diacetate)。

②吞噬功能實(shí)驗(yàn)：單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)是機(jī)體的主要防御系統(tǒng)之一。FCM可以快速、定量地檢查吞噬細(xì)胞的吞噬能力和速度。

③I型變變態(tài)反應(yīng)的IgE受體細(xì)胞、IgE結(jié)合因子的檢查。

④胞漿Ig及血清Ig分析，血小板表面的IgG測定，等等。

3．在臨床方面的應(yīng)用FCM在臨床診斷、療效評(píng)價(jià)和預(yù)后預(yù)測等方面都發(fā)揮了一定的作用。工作做得較多的主要在腫瘤學(xué)、血液病學(xué)等。這些都和FCM在熒光細(xì)胞化學(xué)中的直接應(yīng)用有關(guān)。

（1)癌前病變的檢測和預(yù)后評(píng)價(jià)：有效地發(fā)現(xiàn)癌前病變而給予阻斷治療，無疑是腫瘤防治的重要環(huán)節(jié)　。FCM的探測對(duì)象主要是癌前細(xì)胞，即那些處于正常細(xì)胞向癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化的量變階段、尚未達(dá)到質(zhì)變的細(xì)胞。研究表明，除心肌、肝組織及精子細(xì)胞外，人類正常的體細(xì)胞都具有恒定的DNA二倍體含量，而那些癌前細(xì)胞和癌細(xì)胞則在其發(fā)生發(fā)展過程中伴有DNA含量變化異常。另在資料表明：癌前病變向癌變的轉(zhuǎn)化發(fā)生率與細(xì)胞的不典型增生程度有關(guān)，而細(xì)胞的不典型增生程度又與DNA含量的異常改變呈平行關(guān)系。利用FCM可以定量地測出癌前細(xì)胞的DNA含量并根據(jù)DNA分布直方圖直觀地反映出細(xì)胞的周期分布狀態(tài)，從而了解到癌前細(xì)胞增殖能力變化的動(dòng)態(tài)過程，這樣便可以獲得一些從組織形態(tài)學(xué)中難以得到的信息。

表10-1 是以胃粘膜為例比較正常細(xì)胞和胃癌細(xì)胞在DNA含量及細(xì)胞周期分布方面的差異。

表10-1　正常與胃癌的胃粘膜細(xì)胞DNA含量方面的差異

從表中看出差異是顯著的。我國一些學(xué)者也提出有關(guān)FCM診斷癌腫細(xì)胞的細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)，并已付之臨床應(yīng)用。

目前，對(duì)于癌癥病人預(yù)后評(píng)估的主要依據(jù)是病理組織學(xué)分級(jí)和臨床分期等指標(biāo)，不少人已認(rèn)識(shí)到用FCM來檢測DNA是對(duì)腫瘤預(yù)后評(píng)價(jià)的一個(gè)較為客觀有效的指標(biāo)。總的傾向是：異倍體的出現(xiàn)是惡性腫瘤的一個(gè)標(biāo)志；異倍體腫瘤的惡性程度高、復(fù)發(fā)率高、轉(zhuǎn)移率高及死亡率高；二倍體及近二倍體腫瘤預(yù)后較好。

在臨床血液學(xué)方面的應(yīng)用目前也以血液系統(tǒng)的腫瘤診斷、分型和預(yù)后關(guān)系等方面的應(yīng)用為主；其主要技術(shù)途徑也是基于對(duì)DNA倍體分析和細(xì)胞增殖周期的分析。限于篇幅不再多敘。有關(guān)的技術(shù)細(xì)節(jié)　將在下節(jié)　以FCM在外周血白細(xì)胞的免疫組織化學(xué)分析方面的應(yīng)用為例詳加介紹。

（2)DNA指數(shù)：由于DNA的非整倍體細(xì)胞是腫瘤的特異性標(biāo)志已經(jīng)得到腫瘤學(xué)界的公認(rèn)，在些學(xué)者提出建議采用流式細(xì)胞術(shù)DNA分級(jí)指數(shù)（Flow cytometry DNA Crading Index, 簡稱DNA指數(shù)或DI)表示DNA含量的異常程度。根據(jù)1984年國際分析細(xì)胞學(xué)會(huì)名詞審定委員會(huì)的規(guī)定：

一般樣品應(yīng)采用同種或同個(gè)體的正常細(xì)胞為標(biāo)準(zhǔn)二倍體細(xì)胞。在血液學(xué)研究中通常以正常人外周血淋巴細(xì)胞作為標(biāo)準(zhǔn)二倍體細(xì)胞。需要指出的是，在報(bào)告DNA的測定結(jié)果時(shí)必需包括G₀/G₁峰的變異和系數(shù)，即C.V值，若有多個(gè)DNA干系則要給出各個(gè)G₀/G₁峰的C.V值。用于腫瘤臨床診斷的總體依據(jù)是：a.正常二倍體的DI=1.0，判斷為陰性；b.出現(xiàn)二個(gè)或多個(gè)可以分辨的G₀/G₁峰則可判斷為陽性；c.雖無明顯的G₀/G₁峰的分化現(xiàn)象，但峰的C.V值較大，則可根據(jù)DI數(shù)個(gè)及其它有鑒別意義的征狀給出參考性的診斷。

以上我們主要從FCM在生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用的基本原理和技術(shù)途徑介紹了和組織化學(xué)有關(guān)的內(nèi)容，至于一些技術(shù)細(xì)節(jié)　則在下節(jié)　做較為詳細(xì)的說明。