第三部分 其他微生物學(xué)
實(shí)驗(yàn)二十 衣原體、立克次體、支原體
一、衣原體
衣原體(chlamydia)是一類營(yíng)嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生，有獨(dú)特發(fā)育周期的原核細(xì)胞型微生物。其培養(yǎng)方法類似病毒，有雞胚接種、組織培養(yǎng)和動(dòng)物感染。沙眼衣原體的培養(yǎng)方法主要為前兩種。從沙眼患者眼結(jié)膜刮取的標(biāo)本或經(jīng)培養(yǎng)的材料，均可觀察到在宿主細(xì)胞漿中的包涵體。本實(shí)驗(yàn)采用雞胚培養(yǎng)法。
沙眼衣原體的培養(yǎng)和包涵體的觀察
【材料與方法】
1．從沙眼患者眼結(jié)膜上穹窿病變部位刮取標(biāo)本，將其放入2～3ml肉湯或Hanks液(含有2500ug/ml的鏈霉素)中。
2．將標(biāo)本接種5～8d齡雞胚卵黃囊，每個(gè)雞胚接種0.2ml。每份標(biāo)本接種3～5個(gè)雞胚，置35℃孵育。
3．直至雞胚表現(xiàn)出血、垂死或死亡時(shí)，取出卵黃囊，用生理鹽水漂洗后，剪碎囊膜制成混懸液。
4．用懸液制成推片，待干后作姬姆薩染色，鏡檢觀察包涵體。
【結(jié)果】
染色片可見(jiàn)細(xì)胞外有大量原體，雞胚卵黃囊細(xì)胞淺藍(lán)色的胞漿內(nèi)可見(jiàn)染成深藍(lán)色的包涵體，有4種典型形態(tài)。
散在型：呈圓形或卵圓形，散布于胞漿中，1個(gè)上皮細(xì)胞內(nèi)可有1～3個(gè)或更多。
帽型：緊貼于細(xì)胞核上，呈帽狀。
桑椹型：呈長(zhǎng)梭形/橢圓形，由原體或始體集成桑椹狀。
填塞型：主要由原體構(gòu)成，充滿細(xì)胞漿，將細(xì)胞核擠壓變形。
二、立克次體醫(yī).學(xué)全在線
立克次體(rickettsia)是一類專性細(xì)胞內(nèi)寄生的微生物。在自然界，天然寄生于蚤、蜱、螨等節(jié)肢動(dòng)物體內(nèi)，并以此類節(jié)肢動(dòng)物為媒介，傳染給動(dòng)物或人而引起各種疾病，如斑疹傷寒、恙蟲(chóng)病等。
立克次體多為球桿狀，結(jié)構(gòu)似細(xì)菌，有細(xì)胞壁和細(xì)胞膜；專性細(xì)胞內(nèi)寄生，用馬氏(Macchiavello)染色為紅色，姬姆薩(Gimenza)染色呈m.zxtf.net.cn紫色。油鏡觀察立克次體在細(xì)胞分布位置不同，可作鑒別用。如普氏立克次體常散在于胞漿中，恙蟲(chóng)病立克次體在胞漿內(nèi)靠近核旁成堆排列，而斑點(diǎn)熱立克次體在胞漿或胞核內(nèi)均可找到。
恙蟲(chóng)病立克次體形態(tài)與培養(yǎng)特性
【材料與方法】
1．恙蟲(chóng)病立克次體雞胚卵黃囊接種培養(yǎng)后卵黃囊膜涂片。
2．姬姆薩染色鏡檢。
【結(jié)果】
姬姆薩染色呈紫色多形態(tài)，但大多為球桿狀，胞漿內(nèi)靠近核旁成堆排列。
三、支原體
支原體(mycoplasma)是一類能用人工培養(yǎng)基培養(yǎng)的最小微生物，由于缺乏細(xì)胞壁，因而其形態(tài)呈高度多形性。在營(yíng)養(yǎng)高的人工固體培養(yǎng)基上，形成微小集落(圖20-1)。支原體感染人體后，在血清中產(chǎn)生抗體，可通過(guò)冷凝集試驗(yàn)檢測(cè)。
圖20-1 人型支原體在固體培養(yǎng)基上典型油煎蛋狀菌落，
解脲脲原體在固體培養(yǎng)基上呈微小菌落(箭頭指向)
【材料與方法】
1．支原體的人工培養(yǎng)(以口腔內(nèi)支原體為例)
(1)用棉拭子在Hotfick培養(yǎng)基平板上密集劃線，接種2個(gè)平板。
(2)將一個(gè)平板置5%CO2、95%N2環(huán)境中，另一平板置普通溫箱，37℃培養(yǎng)1～2W。培養(yǎng)過(guò)程中應(yīng)保持一定濕度，以免平板干裂。
(3)一周后每日觀察平板上有無(wú)小集落生長(zhǎng)。
2．支原體的集落和形態(tài)觀察
(1)低倍鏡下選擇1個(gè)集落，連同瓊脂切下置載玻片上，集落面向載玻片。將載玻片放入80～85℃熱水中，見(jiàn)瓊脂發(fā)白脫落即取出。自然干燥后，作姬姆薩染色，觀察集落。
(2)取支原體集落涂片，作姬姆薩染色，觀察形態(tài)。
【結(jié)果】
(1)初次分離時(shí)，約1W在平板上可見(jiàn)微小集落。染色后低倍鏡下可見(jiàn)集落呈“油煎蛋”狀，即圓形，邊緣整齊，較透明，色淺淡。集落中心著藍(lán)紫色。
(2)涂片在鏡下見(jiàn)支原體呈高度多形性，常有球形、桿狀、絲狀、環(huán)狀、分支狀和顆粒狀，染成藍(lán)紫色。
