專題講座二——蛋白多糖阻抑：涎腺腫瘤治療的新思路
主講人 王潔教授
涎腺腫瘤是口腔頜面部常見的一大類腫瘤，其發(fā)病率較高，發(fā)病部位較廣。由于腫瘤性肌上皮細胞的存在、增殖和分化，導致了涎腺腫瘤組織形態(tài)學的多樣性和復雜性，以及良、惡性腫瘤生物學行為上的差異。不同類型的涎腺腫瘤在不給臨床表現(xiàn)、影像學特征、回答治療和預(yù)后等方面均不相同，給臨床診斷和治療帶來困難。
腫瘤性肌上皮細胞（neoplasticmyoepithelial cells, NMCs)是涎腺腫瘤中主要增生的細胞成份，NMCs具有分泌產(chǎn)生蛋白多糖（proteoglycan,PG)的功能，PG作為細胞外基質(zhì)（Extracellularmatrix，ECM)的組成部分，在涎腺腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要的意義和作用。
蛋白多糖的組成和種類
蛋白多糖是一類大分子糖蛋白，由葡胺多糖（glycosaminoglycans，GAGs)鏈以共價鍵形式與核心蛋白（core protein)結(jié)合，形成多聚陰離子線性結(jié)構(gòu)。核心蛋白因表達細胞不同，具有不同的結(jié)構(gòu)和功能。至今已明確，大約有超過20種的核心蛋白存在。GAGs側(cè)鏈主要包括：硫酸乙酰肝素、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸角質(zhì)素、硫酸肝素、肝素及透明質(zhì)酸等。除透明質(zhì)酸外，其余PG都經(jīng)歷硫酸化過程。同一核心蛋白上可以結(jié)合不同的GAGs，不同的核心蛋白和不同的GAG組合構(gòu)成種類多樣的PG，并賦予其各自不同的功能。
作為細胞外基質(zhì)的主要成份，PG在影響實質(zhì)細胞的增殖、分化、形態(tài)構(gòu)成、遷移及信號轉(zhuǎn)導等方面具有重要作用，并與一些生長調(diào)節(jié)物質(zhì)及蛋白酶類結(jié)合并呈現(xiàn)出對實質(zhì)細胞生長、粘附、遷移的調(diào)控作用。
涎腺腫瘤中的蛋白多糖
在涎腺腫瘤中，含有NMCs的腫瘤結(jié)構(gòu)復雜、形態(tài)多樣，生物特性各異，突出的表現(xiàn)為上皮細胞的間質(zhì)化，即出現(xiàn)了間質(zhì)樣物質(zhì)的大量分泌和堆積。
本研究室對涎腺多形性腺瘤、肌上皮瘤及腺樣囊性癌中NMCs的示蹤觀察發(fā)現(xiàn)，正常肌上皮細胞不具有分泌PG的功能；而在涎腺腫瘤中，NMCs獲得了分泌產(chǎn)生PG的功能，并通過胞吐作用將PG分泌至細胞外基質(zhì)中，不僅與膠原纖維、彈性纖維等一起構(gòu)成細胞外間質(zhì)，還引起細胞間橋粒斷裂，使得NMCs脫落下來，成為多形性腺瘤黏液軟骨樣區(qū)域中的細胞來源。
組織學觀察顯示，PG主要存在于涎腺腺樣囊性癌的囊樣腔隙和的多形性腺瘤的黏液軟骨樣區(qū)域中，主要種類有：硫酸乙酰肝素蛋白多糖（heparan sulphate proteoglycan, HSPG)；硫酸角質(zhì)素蛋白多糖（keratan sulphate proteoglycan, KSPG)和硫酸軟骨素蛋白多糖（chondroitin sulfate proteoglycans，CSPG)和透明質(zhì)酸（hyaluronan，HA)。
人木糖基轉(zhuǎn)移酶在蛋白多糖生物合成中的作用
目前已知的人木糖基轉(zhuǎn)移酶（xylosyltransferase)有兩種：人木糖基轉(zhuǎn)移酶-I （xylosyltransferase：XT-I)和人木糖基轉(zhuǎn)移酶-II （xylosyltransferase：XT-II)。XT-I在PG生物合成中起中心調(diào)控作用。以硫酸化蛋白多糖為例，PG生物合成過程為：1)首先合成PG核心蛋白的多肽鏈；2)在木糖基轉(zhuǎn)移酶-XT的催化作用下將一分子木糖基從尿苷二磷酸一木糖（UDP-D-xylose)連接到核心蛋白的絲氨酸一甘氨酸序列的絲氨酸殘基的羥基上，形成O一糖苷鍵；3)木糖由半乳糖轉(zhuǎn)移酶催化連接2個半乳糖殘基形成為三糖核心區(qū)；4)再由高度特異的糖基轉(zhuǎn)移酶作用逐漸按順序延長，依次加上葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖，形成四糖核心區(qū)：GlcAβ1-3Galβ1-3Galβ1-4Xylβ 1-O-Ser。這一四糖區(qū)的形成是所有PG形成過程中必須的相同過程；5)N-去乙酰化和N-硫酸www.med126.com化。隨著GAGs的合成，N-乙酰葡萄糖胺（G1cNAc)的N-乙酞基由N-硫酸基取代。這個N-去乙酰化和N-硫酸化的反應(yīng)均由磺基轉(zhuǎn)移酶催化。這種特異性硫酸化不但賦予GAGs高密度的負電荷，而且也使GAGs具有能與其他的細胞外基質(zhì)分子和生長因子相互作用的能力；6)在糖醛酸C5-異構(gòu)酶作用下，葡萄糖醛酸C-5異構(gòu)為艾杜糖醛酸。因此，XT-I是人體PG生物合成中的關(guān)鍵性起始酶。
2000年由Christian Götting等第一次分離出XT-II。經(jīng)過研究證實，XT-II具有與XT-I 55%相同的的氨基酸序列，是與XT-I結(jié)構(gòu)相似而特性不同的木糖基轉(zhuǎn)移酶，二者都能夠啟動木糖連接類氨基葡聚糖的生物合成，而且同樣具有參與PG生物合成的功能。
蛋白多糖在涎腺肌上皮腫瘤發(fā)生中的作用
通過生化試驗、組織病理學分析及電鏡研究均顯示，涎腺多形性腺瘤和涎腺腺樣囊性癌、肌上皮瘤結(jié)構(gòu)中含有不同種類的PG（GAGs)，并且GAGs主要由NMCs分泌產(chǎn)生。因此，不同種類GAGs的合成分泌造成腫瘤細胞的組織形態(tài)的多樣性[7, 8]。
研究報道，在涎腺多形性腺瘤中既存在小分子PG，如decornin和biglycan （HSPG一種)、lumican （硫酸皮膚素的一種，富含小分子亮氨酸)，也存在大分子PG，如versican和 aggrecan （均屬CSPG)。有研究表明，它們對于涎腺多形性腺瘤的黏液軟骨分化作用關(guān)鍵，均參與多形性腺瘤和腺樣囊性癌等結(jié)構(gòu)中間質(zhì)樣區(qū)域的構(gòu)成；并且它們的表達水平與涎腺多形性腺瘤和腺樣囊性癌的分化程度密切相關(guān)。
PG種類和構(gòu)成比例在涎腺腫瘤中變化，對腫瘤的影響不盡相同。CSPG和HA類PG似乎在涎腺多形性腺瘤的黏液軟骨化中起重要作用；而HSPG則在涎腺腺樣囊性癌中表現(xiàn)較強的影響。
在最初形成的小囊樣腔隙的腺樣囊性癌中，腫瘤細胞表達高水平HSPG mRNA，而擁有較大囊樣腔隙的腺樣囊性癌中HSPG 的mRNA水平極低。這種變化可能是小囊樣腔隙相互融合擴大成大囊樣腔隙的篩狀結(jié)構(gòu)過程中，需要PG供給細胞能量并介導小囊樣腔隙間細胞的粘附，因此，PG被認為是誘導腺樣囊性癌篩孔狀結(jié)構(gòu)構(gòu)成，并提供腫瘤細胞增殖的物質(zhì)基礎(chǔ)。
另外，在使用富含基底膜物質(zhì)（IV型膠原、HSPG)的培養(yǎng)液中培養(yǎng)的腺樣囊性癌ACC-2細胞可形成篩孔樣囊腔結(jié)構(gòu)。在黏液軟骨樣區(qū)豐富的涎腺多形性腺瘤腫瘤區(qū)域當中，腫瘤細胞增殖較快。有學者認為，PG富含液體成份、具有良好的組織通透性，代謝性能快，在缺乏血供的黏液軟骨m.zxtf.net.cn/kuaiji/樣區(qū)域和篩孔結(jié)構(gòu)中，PG是腫瘤細胞主要的營養(yǎng)來源，為腫瘤細胞的生物學行為提供微環(huán)境。在富含PG的肌上皮細胞瘤中，CSPG表達約占ECM的78%，這種軟骨樣基質(zhì)可以吸附大量陽離子生長因子，以及蛋白酶抑制物，其作用也表現(xiàn)為促進瘤體生長增殖。
蛋白多糖為涎腺腫瘤的復發(fā)、侵襲和轉(zhuǎn)移提供營養(yǎng)
ECM與涎腺腫瘤的轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，ECM中基底膜是一種無細胞成分的均質(zhì)狀物質(zhì)，主要包括：PG、IV型膠原、彈性纖維等，基底膜分子（IV型膠原、HSPG)對于涎腺腫瘤細胞和間質(zhì)細胞的增殖影響極大，并且在腫瘤的侵襲過程中參與組織重建。
臨床資料顯示：涎腺腺樣囊性癌組織學結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)移特性與PG密切相關(guān)。富含PG的篩狀型腺樣囊性癌的轉(zhuǎn)移侵襲能力較低，遠處轉(zhuǎn)移發(fā)生率明顯低于PG匱乏的實性型腺樣囊性癌，PG似乎是腫瘤的抑制因素；但篩狀型腺樣囊性癌易復發(fā)的特性以及涎腺多形性腺瘤術(shù)后的種植和復發(fā)，又與PG密切相關(guān)。
在應(yīng)用免疫電鏡和原位雜交技術(shù)對五種涎腺腺樣囊性癌ACC細胞株的檢測中均發(fā)現(xiàn)，腺樣囊性癌ACC細胞產(chǎn)生470kDa核心蛋白的HSPG，它與IV型膠原等ECM共同影響腺樣囊性癌ACC細胞的轉(zhuǎn)移活性。
轉(zhuǎn)移能力不同的腺樣囊性癌ACC細胞株有不同PG的表達。衛(wèi)晉雄曾比較腺樣囊性癌ACC-M與其母系細胞ACC-2中HSPG指出：具有較高轉(zhuǎn)移活性的腺樣囊性癌ACC-M細胞的HSPG表達明顯高于ACC-2，并且ACC-M細胞中的HSPG合成速度與沉積于細胞外基質(zhì)的能力均明顯高于ACC-2細胞。在對ACC-2細胞研究中發(fā)現(xiàn)，ACC-2細胞在富含蛋白多糖的基質(zhì)中培養(yǎng)，其粘附、擴散、生長功能均增強。
隨著研究的不斷深入，利用PG進行腫瘤治療的實驗研究也取得一定進展，
本研究室最近研究發(fā)現(xiàn)，通過RNA干擾技術(shù)抑制涎腺腺樣囊性癌高轉(zhuǎn)移細胞株ACC-M的XT-I基因的表達，阻斷其PG的合成與分泌后，ACC-M細胞的增殖、遷移及轉(zhuǎn)移能力均明顯降低，表明通過阻抑NMCs的PG合成與分泌，能夠有效阻抑涎腺腺樣囊性癌的增殖、遷移及轉(zhuǎn)移的生物學行為，為涎腺腫瘤的臨床治療提供新思路和新策略。
蛋白多糖在涎腺腺樣囊性癌嗜神經(jīng)生長過程中的作用
以往的研究表明，涎腺腺樣囊性癌發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移較少見，但極易出現(xiàn)神經(jīng)侵襲。腫瘤侵襲神經(jīng)可以表現(xiàn)為包裹神經(jīng)，破壞神經(jīng)束膜，侵襲神經(jīng)纖維束，或沿神經(jīng)纖維束生長，甚至可以出現(xiàn)沿神經(jīng)束膜的跳越式轉(zhuǎn)移。因此神經(jīng)浸潤也被認為是腺樣囊性癌遠處轉(zhuǎn)移的一條途徑。
目前對涎腺腺樣囊性癌嗜神經(jīng)生長機理的研究，尚無確切定論。其研究內(nèi)容主要集中在腫瘤細胞出現(xiàn)雪旺細胞分化、神經(jīng)營養(yǎng)因子及其受體、神經(jīng)細胞粘附分子，其它蛋白如細胞間粘附分子-5、整合素（integrin)、細胞外基質(zhì)、基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑等方面。但這些機理仍不足以解釋腫瘤的嗜神經(jīng)現(xiàn)象。
通過對涎腺腫瘤中PG研究發(fā)現(xiàn)，PG為腫瘤生長提供相對疏松、營養(yǎng)豐富的環(huán)境，利于腫瘤細胞穿過致密的結(jié)締組織，向神經(jīng)方向遷移，可能成為其嗜神經(jīng)生長的有利條件。另外，PG在其它有神經(jīng)侵襲現(xiàn)象的腫瘤中也出現(xiàn)了高表達，如前列腺癌含有大量的透明質(zhì)酸以及硫酸軟骨素等。這些都提示PG可能在腫瘤的嗜神經(jīng)生長過程中發(fā)揮重要的作用。
在生理情況下，主要存在于神經(jīng)系統(tǒng)細胞外基質(zhì)中的凝集素蛋白聚糖（lecticans)家族包括neurocan、brevican、aggrecan和versican，可以與神經(jīng)系統(tǒng)中的肌腱蛋白（tenascin-R)等大分子物質(zhì)結(jié)合，通過表面透明質(zhì)酸結(jié)合域和C型凝集素介導富含透明質(zhì)酸的細胞外基質(zhì)的在神經(jīng)周圍聚集。這些分子物質(zhì)可能使神經(jīng)成為涎腺腺樣囊性癌侵襲的靶目標。而且大量的PG還可以為腫瘤細胞提供充足的營養(yǎng)物質(zhì)，可以使其腫瘤細胞在結(jié)構(gòu)致密的周圍神經(jīng)纖維束內(nèi)不斷增殖、浸潤，從而促進腫瘤的嗜神經(jīng)生長。
蛋白多糖與涎腺腫瘤種植性生長的關(guān)系
轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的獨特生物學特征，嚴重影響腫瘤的預(yù)后。種植性生長作為惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移方式之一，主要見于胸腹腔等體腔內(nèi)器官的惡性腫瘤，侵及器官表面時，瘤細胞可以脫落，像播種一樣種植在體腔其它器官表面，形成多個轉(zhuǎn)移性腫瘤。這種播散方式稱為種植性轉(zhuǎn)移。
一般認為腫瘤的惡性程度越高，越容易種植、復發(fā)。以往的臨床研究發(fā)現(xiàn)，涎腺良、惡性腫瘤，形態(tài)結(jié)構(gòu)復雜多樣，如涎腺多形性腺瘤，雖然其形態(tài)學表現(xiàn)為良性腫瘤，因含有大量PG的黏液軟骨樣區(qū)域，腫瘤在手術(shù)后極易出現(xiàn)種植和復發(fā)。在以往的研究中，發(fā)現(xiàn)篩狀型涎腺腺樣囊性癌易復發(fā)的特性以及多形性腺瘤術(shù)后的種植和復發(fā)，與PG密切相關(guān)。
在其它系統(tǒng)的腫瘤研究過程中，有研究報道，硫酸肝素類及硫酸軟骨素類PG參與介導了腹膜癌肉瘤（PC880)、卵巢癌（ES-2)及骨髓瘤細胞的粘附與種植，Versican也參與調(diào)控前列腺癌細胞與細胞外基質(zhì)間的粘附，而促進其腫瘤細胞的種植性生長。
由此可見，PG對涎腺腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后都有著不可忽視的重要作用。我們通過阻抑涎腺腫瘤性肌上皮細胞NMCs的PG合成分泌，有效抑制了涎腺腺樣囊性癌的增殖、浸潤、遷移和遠處轉(zhuǎn)移等侵襲能力，表明PG阻抑，對于涎腺腫瘤有明顯的阻抑作用，可望成為涎腺腫瘤治療的一種新途徑，為涎腺腫瘤的臨床治療開創(chuàng)新思路，提供新策略。
