一種同時檢測對蝦白斑綜合癥和托拉綜合癥病毒的核酸點雜交方法
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公開(公告)號
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CN1197977C
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公開(公告)日
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2005.04.20
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申請(專利)號
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CN03119088.X
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申請日期
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2003.05.19
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專利名稱
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一種同時檢測對蝦白斑綜合癥和托拉綜合癥病毒的核酸點雜交方法
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主分類號
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C12Q1/68
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分類號
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C12Q1/68;C12P19/34;G01N33/569
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分案原申請?zhí)? |
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優(yōu)先權
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申請(專利權)人
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中國科學院武漢病毒研究所
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發(fā)明(設計)人
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石正麗;袁軍法
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地址
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430071 湖北省武漢市武昌小洪山
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頒證日
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國際申請
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進入國家日期
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專利代理機構
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武漢宇晨專利事務所
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代理人
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王敏鋒
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國省代碼
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湖北;42
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主權項
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一種同時檢測對蝦白斑綜合癥和托拉綜合癥病毒的核酸點雜交方法，包括下列步驟：(1)制備試劑盒：包括病毒核酸探針、樣品處理液、雜交液，封閉液、抗地高辛抗體、洗滌液、顯色劑、陽性對照、陰性對照、1.5ml離心管、雜交膜、雜交袋、研磨小棒；(2)探針的制備：地高辛探針和生物素探針的制備用常規(guī)PCR方法，將對蝦白斑綜合癥和托拉綜合癥病毒PCR產物分別標記上地高辛和生物素，擴增引物設計來自對蝦白斑綜合癥探針的序列，上游引物ACCACAATGACCGTAAGG；下游引物TGTACCTACAAGAGTGATTGG和托拉綜合癥病毒探針的序列，上游引物：AACGCGCATTGCTTCTTTT；下游引物：TCCTCCACTGGTTGTTGTAT；擴增模板來自對蝦白斑綜合癥和托拉綜合癥病毒核酸；(3)樣品處理：稱取樣品，放入1.5ml的離心管內，加入樣品處理液，用研磨小棒研磨直至組織被研碎，調pH至7.5，低速離心后取上清，用TN緩沖液按1∶10稀釋，95℃處理10min并放置冰上；(4)預雜交和雜交：將雜交膜放入雜交袋內，加入預雜交液使雜交膜被溶液覆蓋，封閉好雜交袋，在42℃預雜交1-4小時，然后雜交袋內加入探針雜交液，42℃雜交過夜；(5)洗滌：將雜交膜放在干凈的平皿內，用洗滌液在室溫條件下洗滌2次，將雜交膜重新放回干凈的雜交袋內，加入洗滌液在68℃洗滌2次，每次15min；(6)封閉：棄洗滌液，加入1％封閉液，室溫下孵育30min；(7)抗體抗原反應：用緩沖液稀釋抗地高辛抗體和生物素抗體，放入雜交袋內，37℃下孵育30min；(8)洗滌：取出雜交膜放在干凈的平皿內，用緩沖液在室溫下連續(xù)洗滌2次；(9)顯色：用緩沖液配置顯色底物，將雜交膜放在干凈的雜交袋內，放入顯色底物覆蓋雜交膜，在避光處顯色，肉眼觀察結果，顯棕色為陽性反應；(10)終止反應：棄顯色液，加終止液，并以緩沖液漂洗，記錄結果；(11)再度顯色：用緩沖液配置顯色底物，將雜交膜放在干凈的雜交袋內，放入顯色底物覆蓋雜交膜，避光顯色，肉眼觀察結果，僅感染WSSV為藍紫色，同時感染兩種病毒的陽性結果為棕色和藍紫色的疊加；(12)終止反應：棄顯色液，加終止液，記錄結果。
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摘要
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本發(fā)明公開了一種同時檢測對蝦白斑綜合癥和托拉綜合癥病毒的核酸點雜交方法，其步驟是：首先是探針的制備；其次是樣品處理；第三是預雜交和雜交；第四洗滌；第五是封閉；第六是抗體抗原反應；第七是洗滌；第八是兩步顯色反應；最后終止反應。本發(fā)明能同時檢測兩種病毒，靈敏度高，成本低，適合于對蝦白斑綜合癥和托拉綜合癥病毒的診斷以及親蝦、幼苗和成蝦的健康狀態(tài)檢測。
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國際公布
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