氨酰基轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸合成酶識別型蛋白芯片的制備方法
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公開(公告)號
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CN1485434A
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公開(公告)日
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2004.03.31
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申請(專利)號
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CN02139106.8
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申請日期
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2002.09.26
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專利名稱
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氨�；D(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸合成酶識別型蛋白芯片的制備方法
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主分類號
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C12Q1/48
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分類號
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C12Q1/48
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分案原申請?zhí)? |
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優(yōu)先權(quán)
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申請(專利權(quán))人
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中國科學(xué)院武漢病毒研究所
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發(fā)明(設(shè)計(jì))人
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謝斌;孟慶來;謝衛(wèi)紅
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地址
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430071湖北省武漢市武昌小洪山
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頒證日
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國際申請
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進(jìn)入國家日期
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專利代理機(jī)構(gòu)
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武漢科宏專利事務(wù)所
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代理人
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王敏鋒
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國省代碼
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湖北;42
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主權(quán)項(xiàng)
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一種氨�；D(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸合成酶識別型蛋白芯片的制備方法，包括下列步驟：A、制備熒光物質(zhì)IAEDANS標(biāo)記的轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸；B、把精氨酰轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸合成酶基因和strep-tag序列進(jìn)行基因重組，并合成精氨酰轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸合成酶-strep-tag融合蛋白，回收后用液閃記數(shù)儀來檢測其活力；C、向表面修飾有親和素的芯片樣孔中加入反應(yīng)試劑，使其終濃度為精氨酰轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸合成酶-strep-tag融合蛋白50到100nmol/L，氯化鈉為150nmol/L，乙二胺四乙酸鈉為1mmol/L，在PH8.0，20℃條件下溫浴20分鐘，使精氨酰轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸合成酶-strep-tag融合蛋白固定到芯片表面，再用無菌水清洗，4℃晾干；D、向固定化精氨酰轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸合成酶的樣孔中加入反應(yīng)試劑，使其終濃度為Tris/鹽酸50mmol/L，氯化鎂8mmol/L，三磷酸腺苷4mmol/L，熒光IAEDANS標(biāo)記的精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸534μmol/L，在PH7.4，37℃下溫浴5到7分鐘，使精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸分子均勻而穩(wěn)定的結(jié)合到精氨酰tRNA合成酶上，后用氯化鎂8mmol/L，三磷酸腺苷4mmol/L混合液清洗芯片表面，4℃晾干；E、向步驟D中制備的精氨酰轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸合成酶-精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸復(fù)合物中加入反應(yīng)試劑，使終濃度為精氨酸0.1mmol/L，乙二胺四乙酸鈉為0.1mmol/L，氯化鉀80mmol/L，二硫蘇糖醇0.5mmol/L，在37℃，PH7.4條件下溫浴5分鐘后，停止反應(yīng)，以氯化鎂8mmol/L，三磷酸腺苷4mmol/L混合液清洗芯片；F、把甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、洛氨酸、色氨酸、組氨酸、脯氨酸相應(yīng)氨酰基轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸合成酶的基因都與strep-tag制成融合蛋白，再重復(fù)A、B、C、D、E的步驟在一塊芯片的20個(gè)孔中陣列固相出20種不同的氨�；D(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸合成酶-轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸復(fù)合物，制成氨酰基轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸合成酶識別型芯片。
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摘要
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本發(fā)明公開了一種氨�；D(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸(tRNA)合成酶識別型蛋白芯片的制備方法，它適用于蛋白質(zhì)中基本氨基酸組分的檢測。其特征在于將組成蛋白質(zhì)的20種基本氨基酸對應(yīng)的氨�；D(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸合成酶(AARS)以陣列形式固定到芯片表面，再在一定條件下把20種熒光標(biāo)記的轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸固定到相應(yīng)的合成酶上去，形成轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸-氨�；D(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸合成酶芯片。該芯片就可利用氨�；D(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸合成酶對其相應(yīng)氨基酸的特異識別作用來檢測該種氨基酸在蛋白質(zhì)中存在與否。最后綜合20個(gè)樣孔的反應(yīng)情況，應(yīng)用熒光掃描可檢測出蛋白質(zhì)中氨基酸的組成。本發(fā)明具有準(zhǔn)確，靈敏，快速，方便的特點(diǎn)。
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國際公布
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