免疫學和免疫學檢驗:第二節(jié)　熒光抗體技術(shù)

一、熒光抗體的制備

（一)抗體的熒光素標記

用于標記的抗體，要求是高特異性和高親和力的。所用抗血清中不應(yīng)含有針對標本中正常組織的抗體。一般需經(jīng)純化提取IgG后再作標記。作為標記的熒光素應(yīng)符合以下要求：①應(yīng)具有能與蛋白質(zhì)分子形成共價健的化學基團，與蛋白質(zhì)結(jié)合后不易解離，而未結(jié)合的色素及其降解產(chǎn)物易于清除。②熒光效率高，與蛋白質(zhì)結(jié)合后，仍能保持較高的熒光效率。③熒光色澤與背景組織的色澤對比鮮明。④與蛋白質(zhì)結(jié)合后不影響蛋白質(zhì)原有的生化與免疫性質(zhì)。⑤標記方法簡單、安全無毒。⑥與蛋白質(zhì)的結(jié)合物穩(wěn)定，易于保存。

常用的標記蛋白質(zhì)的方法有攪拌法和透析法兩種。以FITC標記為例，攪拌標記法為：先將待標記的蛋白質(zhì)溶液用0.5ml/LpH9.0的碳酸鹽緩沖液平衡，隨后在磁力攪拌下逐滴加入FITC溶液，在室溫持續(xù)攪拌4～6h后，離心，上清即為標記物。此法適用于標記體積較大，蛋白含量較高的抗體溶液。優(yōu)點是標記時間短，熒光素用量少。但本法的影響因素多，若操作不當會引起較臺強的非特異性熒光染色。

透析法適用于標記樣品量少，蛋白含量低的抗體溶液。此法標記比較均勻，非特異染色也較低。方法為：先將待標記的蛋白質(zhì)溶液裝入透析袋中，置于含F(xiàn)ITC的0.01mol/LpH9.4碳酸鹽緩沖液中反應(yīng)過夜，以后再對PBS透析法去除游離色素。低速離心，取上清。

標記完成后，還應(yīng)對標記抗體進一步純化以去除未結(jié)合的游離熒光素和過多結(jié)合熒光素的抗體。純化方法可采用透析法或?qū)游龇蛛x法。

（二)熒光抗體的鑒定

熒光抗體在使用前應(yīng)加以鑒定。鑒定指標記包括效價及熒光素與蛋白質(zhì)的結(jié)合比率�？贵w效價可以用瓊脂雙擴散法進行滴定，效價大于1:16者較為理想。熒光素與蛋白質(zhì)結(jié)合比率（F/P)的測定和計算的基本方法是：將制備的熒光抗體稀釋至A₂₈₀1≈1.0，分別測讀A₂₈₀（蛋白質(zhì)特異吸收峰)和標記熒光素m.zxtf.net.cn/wsj/的特異吸收峰，按公式計算。

F/P值越高，說明抗體分子上結(jié)合的熒光素越多，反之則越少。一般用于固定標本的熒光抗體以F/P＝1.5為宜，用于活細胞染色的以F/P＝2.4為宜。

抗體工作濃度的確定方法類似ELISA間接法中酶標抗體的滴定。將熒光抗體自1:4～1:256倍比稀釋，對切片標本作熒光抗體染色。以能清晰顯示特異熒光、且非特異染色弱的最高稀釋度為熒光抗體工作濃度。

熒光抗體的保存應(yīng)注意防止抗體失活和防止熒光猝滅。最好小量分裝，－20℃凍存，這樣就可放置3～4年。在4℃中一般也可存放1～2年。

二、免疫熒光顯微技術(shù)

免疫熒顯微技術(shù)的基本原理是：使熒光抗體與標本切片中組織或細胞表面的抗原進行反應(yīng)，洗滌除去游離的熒光抗體后，于熒光顯微鏡下觀察，在黑暗背景上可見明亮的特異熒光。

（一)標本的制作

熒光顯微技術(shù)主要靠觀察切片標本上熒光抗體的染色結(jié)果作為抗原的鑒定和定位。因此標本制作的好壞直接影響到檢測的結(jié)果。在制作標本過程中應(yīng)力求保持抗原的完整性，并在染色、洗滌和封埋過程中不發(fā)生溶解和變性，也不擴散至臨近細胞或組織間隙中去。標本切片要求盡量薄些，以利抗原抗體接觸和鏡檢。標本中干擾抗原抗體反應(yīng)的物質(zhì)要充分洗去，有傳染性的標本要注意安全。

常見的臨床標本主要有組織、細胞和細菌三大類。按不同標本可制作涂片、印片或切片。組織材料可制備成石蠟切片或冷凍切片。石蠟切片因操作煩瑣，結(jié)果不穩(wěn)定，非特異反應(yīng)強等已少應(yīng)用。組織標本也可制成印片，方法是用洗凈的玻片輕壓組織切面，使玻片粘上1～2層組織細胞。細胞或細菌可制成涂片，涂片應(yīng)薄而均勻。涂片或印片制成后應(yīng)迅速吹干、封裝。置－10℃保存或立即使用。

（二)熒光抗體染色

于已固定的標本上滴加經(jīng)適當稀釋的熒光抗體。置濕盒內(nèi)，在一定溫度下溫育一定時間，一般可用25～37℃30min，不耐熱抗原的檢測則以4℃過夜為宜。用PBS充分洗滌，干燥。

（三)熒光顯微鏡檢查

經(jīng)熒光抗體染色的標本，需要在熒光顯微鏡下觀察。最好在染色當天即作鏡檢，以防熒光消退，影響結(jié)果。

熒光顯微鏡檢查應(yīng)在通風良好的暗室內(nèi)進行。首先要選擇好光源或濾光片。濾光片的正確選擇是獲得良好熒光觀察效果的重m.zxtf.net.cn/job/要條件。在光源前面的一組激發(fā)濾光片，其作用是提供合適的激發(fā)光。激發(fā)濾光片有兩種。MG為紫外光濾片，只允許波長275～400nm的紫外光通過，最大透光度在365nm；BG為藍紫外光濾片，只允許波長325～500nm的藍外光通過，最大透光度為410nm。靠近目鏡的一組阻擋濾光片（又稱吸收濾光片或抑制濾光片)的作用是濾除激發(fā)光，只允許熒光通過。透光范圍為410～650nm，代號有OG（橙黃色)和GG（淡綠黃色)兩種。觀察FITC標記物可選用激發(fā)濾光片BG12，配以吸收濾光片OG4或GG9。觀察RB200標記物時，可選用BG12與OG5配合。

（四)實驗的類型

1．直接法用特異熒光抗體直接滴加于標本上，使之與抗原發(fā)生特異性結(jié)合（圖17-1)。本法操作簡便，特異性高，非特異熒光染色因素少；缺點是敏感度偏低，每檢查一種抗原需制備相應(yīng)的特異熒光抗體。

圖17-1 直接免疫熒光法原理示意圖

2．間接法可用于檢測抗原和抗體，原理見圖17-2。本法有兩種抗體相繼作用，第一抗體為針對抗原的特異抗體，第二抗體（熒光抗體)為針對第一抗體的抗抗體。本法靈敏度高，而且在不同抗原的檢測中只需應(yīng)用一種熒光抗體。

圖17-2 間接免疫熒光法原理示意圖

圖17-3 補體結(jié)合免疫熒光法原理示意圖

3．補體結(jié)合法本法是間接法的第一步抗原抗體反應(yīng)時加入補體（多用豚鼠補體)，再用熒光標記的抗補體抗體進行示蹤（圖17-3)。本法敏感度高，且只需一種抗體。但易出現(xiàn)非特異性染色，加之補體不穩(wěn)定，每次需采新鮮豚鼠血清，操作復雜。因此較少應(yīng)用。

4．標記法本法用FITC及羅丹明分別標記不同的抗體，而對同一標本作熒光染色。在有兩種相應(yīng)抗原存在時，可同時見到橙紅和黃綠兩種熒光色澤。

三、在醫(yī)學檢驗中的應(yīng)用

熒光抗體技術(shù)在臨床檢驗上已用作細菌、病毒和寄生蟲的檢驗及自身免疫病的診斷等。在細菌學檢驗中主要用于菌種的鑒定。標本材料可以是培養(yǎng)物、感染組織、病人分泌排泄物等。本法較其他鑒定細菌的血清學方法速度快、操作簡單、敏感性高，但在細菌實驗診斷中，一般只能作為一種補充手段使用，而不能代替常規(guī)診斷。熒光抗體染色法對腦膜炎奈氏菌、痢疾志賀菌、霍亂弧菌、布氏桿菌和炭疽桿菌等的實驗診斷有較好效果。熒光間接染色法測定血清中的抗體，可用于流行病學調(diào)查和臨床回顧診斷。免疫熒光用于梅毒螺旋體抗體的檢測是梅毒特異性診斷常用方法之一。免疫熒光技術(shù)在病毒學檢驗中有重要意義，因為普通光學顯微鏡看不到病毒，用熒光抗體染色法可檢出病毒及其繁殖情況。

在寄生蟲感染診斷中，間接熒光抗體染色法有非常廣泛的應(yīng)用。間接免疫熒光試驗（IFAT)是當前公認的最有效的檢測瘧疾抗體的方法。常用抗原為瘧疾患者血液中紅內(nèi)期裂殖體抗原。IFAT對腸外阿米巴、尤其是阿米巴肝膿腫也有很高的診斷價值，所用抗原是阿米巴培養(yǎng)物懸液或提取的可溶性抗原。

免疫熒光法還是檢測自身抗體的好工具，在自身免疫病的實驗診斷中應(yīng)用廣泛。其突出優(yōu)點是能以簡單方法同時檢測抗體和與抗體起特異反應(yīng)的組織成分，并能在同一組織中同時檢查抗不同組織成分的抗體。主要有抗核抗體、抗平滑肌抗體和抗線粒體抗體等。抗核抗體的檢測最常采用鼠肝作核抗原，可做成冰凍切片、印片或勻漿。用組織培養(yǎng)細胞如Hep-2細胞或Hela細胞涂片還可檢出抗著絲點抗體、抗中性粒細胞漿抗體等。應(yīng)用免疫熒光技術(shù)可以檢出的其他自身抗體有抗（胃)壁細胞抗體、抗雙鏈DNA抗體、抗甲狀腺球蛋白抗體、抗甲狀腺微粒體抗體、抗骨髓肌抗體及抗腎上腺抗體等。

熒光抗體技術(shù)的一種特殊應(yīng)用是流式細胞分析（flowcytometry)。在這種分析方法中檢測儀器不是熒光顯微鏡，檢測對象不是固定了的標本，而是將游離細胞作熒光抗體特異染色后，在特殊設(shè)計的儀器中通過噴嘴逐個流出，經(jīng)單色激光照射發(fā)出的熒光信號由熒光檢測計檢測，并自動處理各處數(shù)據(jù)。這種方法可用于檢測細胞大小、折散率、粘滯度等，更常用于T細胞亞群等的檢測。