幽門螺桿菌（Helicobacter pylorida, Hp)現(xiàn)被公認(rèn)為是慢性胃炎（CG)及消化性潰瘍（PU)的致病因素之一。測(cè)定血清Hp抗體方法簡(jiǎn)便，敏感性高，特異性強(qiáng)，故日益受到關(guān)注。有關(guān)抗Hp-IgG檢測(cè)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA)已有報(bào)道，但Hp抗原中，哪一部分是免疫反應(yīng)中抗原的決定簇，目前各家均在探討。因此我們對(duì)Hp抗原作了十二烷基磺酸納一聚丙稀酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE)和用人抗血清Hp和兔抗Hp血清作免疫印漬（Western blot)，現(xiàn)報(bào)告如下。
1 材料和方法
1.1 SDS-PAGE
�、貶p抗原：為本室1989～1990年間分離培養(yǎng)的3株Hp抗原混合物。②CT抗原，由上海市衛(wèi)生防疫站惠贈(zèng)。③分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白。④電泳方法：分離膠和濃縮膠的聚丙烯酰胺濃度分別為10%和5%，分離膠的pH為8.8，濃縮膠的pH為6.8。
電泳前先將Hp、CJ全菌經(jīng)超聲粉碎，然后離心（2000r/min)15min，除去沉淀，經(jīng)紫外線檢測(cè)，上清液中蛋白含量為2mg/ml左右，加拌量為60μl，上樣前加20μl的樣品處理液，然后將標(biāo)本煮沸5min。相對(duì)分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白分別為磷酸化酶94000，牛血清蛋白67000，卵蛋白43000，碳酸酐酶30000，大豆胰蛋白酶抑制劑20000，溶菌酶14000與樣品作同步電泳。
1.2 免疫印漬分析
①兔抗人Hp抗體：由本室免疫新西蘭大白兔制成。②陽(yáng)性血清：1989～1990年胃鏡檢查患者血清，1:100稀釋后經(jīng)ELISA后于波長(zhǎng)490nm測(cè)定吸光度（A490)＞0.6者。同時(shí)，胃鏡或胃粘膜病理證實(shí)有炎癥或潰瘍。尿素酶試驗(yàn)陽(yáng)性。③陰性血清：選10歲以下正常兒童血清。1:100稀釋后經(jīng)ELISA測(cè)定后A490＜0.3者。④酶標(biāo)羊抗人IgG的制備：按改良的過碘酸鈉法，由本室制備。⑤酶標(biāo)豬抗兔IgG：丹麥Daco公司產(chǎn)品，由上海市衛(wèi)生防疫站生化免疫室惠贈(zèng)。⑥硝酸纖維素（NC)紙：西德S&S公司產(chǎn)品，由上海市衛(wèi)生防疫站生化免疫室惠贈(zèng)。⑦免疫印漬：按Towbin等方法，由DY-Cl型電泳轉(zhuǎn)移儀以2h400mA將SDS-PAGE膠上的抗原轉(zhuǎn)移至NC紙上。將NC紙置Cohen封閉液中4°C過夜。次日，用含0.05%Tween-20的PBS洗滌3遍，再將NC分別浸于Hp陽(yáng)性血清中（均為1:100稀釋)。37°C振蕩2h后，洗滌3遍，加酶標(biāo)記的羊抗人IGG抗體和豬抗兔IGG抗體（1:400稀釋)。37°C振蕩2h后，洗滌3遍，再用酶底物顯色液（pH7.2的Tris-HCl)緩沖液，0.05%DAB，0.03%的30%H2O2)顯色。
2 結(jié)果
2.1 SDS-PAGE
經(jīng)超聲粉碎后的Hp抗原被SDS-PAGE分離，膠塊用考馬斯亮藍(lán)顯色，可見14條左右的染色帶。其主要染色帶Mr分別為22000，32000，42000，59000，67000和75000。
經(jīng)超聲粉碎后的CJ抗原被SDS-PAGE分離后亦出現(xiàn)了10多條染色帶。主要染色帶Mr88000，75000，66000，45000和32000。
2.2 Western blot
轉(zhuǎn)移至NC上的Hp、CJ超聲粉碎抗原用酶標(biāo)羊抗人IGG抗體分析，發(fā)現(xiàn)在陽(yáng)性血清的NC紙上，可出現(xiàn)三條抗原決定簇條帶，其Mr分別為49000，59000和67000，與文獻(xiàn)報(bào)道相似；加陰性血清的NC紙上，無任何條帶出現(xiàn)。在國(guó)兔抗人Hp抗血清的NC紙上，用酶標(biāo)豬抗兔IGG抗體分析，也出現(xiàn)了Mr67000的條帶，49000和56000的條帶較為模糊。在所有出現(xiàn)Hp抗原決定簇條帶的NC紙上，CJ約在45000處與人抗Hp和兔抗Hp抗體均有一明顯的交叉反應(yīng)帶。提示該條帶并非是因人和兔都同時(shí)會(huì)有抗CJ抗體引起，而是Hp和CJ的表面蛋白抗原間有交叉反應(yīng)。
3 討論
我們用SCS-PAGE加Westen blot將分離培養(yǎng)的3株Hp抗原經(jīng)超聲粉碎后，進(jìn)行抗原成分的分析，在14條左右的候選抗原帶中，發(fā)現(xiàn)其主要的抗原決定簇Mr為49000，59000和67000。由于處理抗原的方法不同（如用福爾馬林固定的整菌抗原、超聲粉碎抗原及酸處理抗原等)，因此，SDS-PAGE的結(jié)果也就不很一致。但目前公認(rèn)Mr60000～70000的條帶是用IGG印漬的Hp主要免疫反應(yīng)帶，與本組結(jié)果相同。印漬帶屬Hp的鞭毛鞘膜蛋白。另外，Dunn等用二維電泳分離Hp蛋白時(shí)，在用125I標(biāo)記的完整Hp菌表面發(fā)現(xiàn)兩種主要蛋白。其中命名為蛋白Ⅱ的（pH5.6-5.8,Mr66000)既是尿素酶抗原的亞單位，也是部分純化的鞭毛蛋白制備物的成分。他們還發(fā)現(xiàn)，蛋白Ⅱ不被完整的CJ、CF抗血清識(shí)別，因此，它是Hp的抗原決定簇。此點(diǎn)與本文也相符。我們沒有發(fā)現(xiàn)110000的Hp特異性蛋白帶，這可能與培養(yǎng)的Hp菌株的不同有關(guān)。當(dāng)然也不能排除與處理抗原的方法不同有關(guān)。
抗原的特異性及標(biāo)準(zhǔn)化至關(guān)重要，它決定了該免疫學(xué)方法的敏感性和特異性。作者試圖通過對(duì)Hp的抗原的SDS-PAGE加Western blot檢測(cè)，找出Hp的特異性抗原決定簇，并以此來取代全菌抗原，建立更為靈敏、特異的血清學(xué)方法，從而有助于由Hp引起感染的流行病學(xué)調(diào)查。由于本文所用的Hp株數(shù)量有限，因此它的抗原決定簇可能代表不了所有的Hp株，但它至少反應(yīng)了1989～1990年間上海地區(qū)感染的Hp菌的抗原決定族。
Clayton等在用基因工程合成的Hp多肽作為抗原與Hp陽(yáng)性血清作免疫印漬時(shí)亦發(fā)現(xiàn)66000的合成多肽是Hp的一個(gè)主要抗原決定簇。這就為今后簡(jiǎn)化Hp菌的培養(yǎng)以及Hp菌的標(biāo)準(zhǔn)化、商品化都提供了很好的前景。
周志輝 許國(guó)銘 張洪富 項(xiàng)兆英
第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院（上海 200003)
