抗幽門螺桿菌尿素酶抗體診斷試劑盒的研制與臨床應用

　　本研究旨在制備純化的標準化、商品化抗Hp尿素酶抗體試劑盒，供臨床ELISA檢測用。

　　1　材料與方法

　　1.1　試劑盒的制備　

　　Hp尿素酶抗原的分離純化研制：①經(jīng)尿素酶試驗選擇尿素酶活性高的經(jīng)系統(tǒng)鑒定的Hp菌株接種于含6％脫纖維綿羊血的布氏平皿中，置微氧環(huán)境，恒溫37℃培養(yǎng)3d收菌，脫洗、稀釋后超聲適度破裂，高速離心取上清液備用。②選用Sephadex G200柱（2.6×75cm柱型)在凝膠過濾成套設備中從Hp超聲破碎物離心上清液中一次提純Hp尿素酶。③將凝膠過濾后尿素活性峰與相應菌全菌蛋白上柱液及離心沉渣SDS－PAGE分析，觀察尿素酶提純效果。④Western blot（免疫印漬)分析：經(jīng)SDS－PAGE將各蛋白分離后，經(jīng)電泳將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，過渡、洗滌后，放入稀釋的兔抗Hp陽性血清（含抗高分子量菌體相關蛋白)中，震蕩、洗滌后，浸泡于稀釋后的辣根過氧化酶—葡萄球菌A蛋白液洗滌后將該膜放入新配制的底物顯色液中，震蕩，顯色，清洗，照相。

　　1.2　試劑盒的臨床應用　

　　研究對象：①病人：診斷按胃鏡及活檢病理確定。同期均檢測Hp抗體。第一階段用全菌抗原（抗Hp抗體)。男741例，女459例，年齡為18歲～77歲（42歲±10歲)。第二階段用商品化試劑盒Hp尿素酶抗原（抗Hp－u抗體)。男1015例，女660例，年齡為16歲～74歲（45歲±7歲)。兩組匹配情況相近。②獻血員：以上兩階段均有健康獻血員同期行Hp抗體檢查，各200例。胃鏡檢查及活檢取材：每例在距幽門5cm周徑內(nèi)的部位鉗取粘膜標本分別送檢病理組織學檢查及Hp培養(yǎng)。組織學檢查：胃鏡活檢標本HE染色組織學檢查，Giemsa染色確認Hp存在。病理診斷參照全國胃癌防治研究協(xié)作組所訂標準。炎癥程度按正常、輕度、中度、重度分別判定為0、1、2、3級。細菌培養(yǎng)：送檢用的輸送培養(yǎng)基為10％小牛血清布氏肉湯培養(yǎng)基。每試管分裝3ml置入2塊胃鏡活檢組織塊。每例活檢鉗均經(jīng)消毒液浸泡15min后和酒精擦試。Hp培養(yǎng)基用布氏瓊脂培養(yǎng)基為基礎為基礎，加入脫纖維羊血及聯(lián)合抗生素、3d后觀察結果，并作生化鑒定。

　　以上組織學與微生物學檢查結果獨立評價，不受臨床資料暗示影響。血清ELISA法測抗HpIgG和抗HpIgG。流行因素調(diào)查：制定統(tǒng)一調(diào)查表逐項登記。本組共連續(xù)調(diào)查了1200例。藥物治療：212例Hp陽性胃炎患者隨機分為3組。分別服諾氟沙星和膠體次枸櫞酸鉍（CBS，De—Nol)及安慰劑1個月。停藥1月后復查胃鏡及血清抗Hp抗體。

　　2　結果

　　2.1　Hp超聲破碎后

　　Hp超聲破碎后，高速離心，上清液可經(jīng)Sephadex G200柱將Hp尿素酶有效分離。尿素酶活性與脫洗第一峰完全一致，而第一峰中經(jīng)SDS—PAGE檢測只含有30kD及66kD兩條蛋白帶。與Hp尿素酶兩個亞基的分子量一致，經(jīng)Western blot分析證明第一峰蛋白仍保持了很高的抗原性。

　　2.2　用提純的Hp尿素酶進行血清抗Hp尿素酶抗體測定

　　用提純的Hp尿素酶進行血清抗Hp尿素酶抗體測定，經(jīng)已確定的55份陽性血清標本和50份陰性血清標本對照檢測，符合率100％。無假陽性及假陰性。

　　2.3　對1675例進行抗HpIgG抗體檢測

　　對1675例進行抗HpIgG抗體檢測。若以培養(yǎng)及（或)組織染色為標準，則ELISA敏感性為98％，特異性96％，陽性預測值為98％，陰性預測值為96％。抗HpIgG抗體半定量結果，本組檢驗以“++”為臨界值標準，敏感性可達98％，特異性達96％；若以“＋”為準，則敏感性雖達99.1％，但特異性僅為84.9％。

　　2.4　各種商品試劑盒比較見表1。提示本組試劑盒檢測Hp感染敏感性和特異性均較高。

　　2.5　各種胃、十二指腸疾病患者血清抗HpIgG抗體檢測情況（見表1)。

　　2.6　流行因素調(diào)查

　　流行因素調(diào)查。 本組資料表明以下因素有意義：①Hp感染率隨年齡增長遞增，至60歲達高峰。②本組肉聯(lián)廠工人（30例)與副食售貨員（菜、肉組)69例抗Hp抗體陽性率分別為90.0％和86.9％，高于其他工種（P＜0.01)。③飲食習慣：喜食涼拌生菜、肉食者Hp感染率高（P＜0.05)。④家庭成員中有胃十二指腸疾病者，較無此類病者Hp感染檢出率高（根據(jù)8個家庭、40名家庭成員統(tǒng)計)。

　　2.7　ELISA血清Hp抗體檢測用于Hp陽性胃炎抗菌物治療后觀察抗體滴度下降（表2)。

表1　各種商品試劑盒比較

　　^a用乳膠凝集試驗，余者ELISA測定。^b非商品化試劑盒

　　3　討論

　　本研究采用ELISA半定量檢測血清抗HpIgG，經(jīng)大宗病例臨床檢測應用，敏感性、特異性高、批內(nèi)、批間差異小，穩(wěn)定性強，重復性好。

表2　三組治療前后血清抗Hp滴度　�。▁±s)

　　經(jīng)自身對照：^aP＞0.05，^bP＜0.01

　　臨床應用觀察到，應用本試劑盒，在慢性胃炎、消化性潰瘍、非潰瘍性消化不良各類疾病中，抗HpIgG檢測陽性率均很高。尤其在慢性活動性胃炎、十二指腸潰瘍中檢出率更高，與文獻報道一致。Sobala強調(diào)血清學Hp抗體檢測可用于篩查消化不良，可減少23.3％病例用胃鏡檢查確立Hp感染。本研究也與之相符。

　　應用血清Hp抗體為觀察指標，來判斷用抗Hp藥物治療根除Hp效果，治療后抗體滴度下降或消失，與近幾年一些報道一致。本文認為，用血清抗HpIgG追訪療效，也可減少患者接受胃鏡復查Hp根除與否之痛苦�？笻pIgG檢測用于流行病學研究無疑是一重要工具。

楊昭徐¹　陳晶晶²　梁丕霞¹　蔣秀高²　孟雅君¹　張建中²　陳　杰¹　侯曼芩¹

¹首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院（100050)

²中國預防醫(yī)學科學院流行病學微生物研究所（100050)