一、抗體產(chǎn)生細(xì)胞的特點(diǎn)
抗體產(chǎn)生細(xì)胞（Antibody – producing cell)即光鏡下所見漿細(xì)胞。有的呈圓形，核居中（稱之為淋巴樣漿細(xì)胞、幼漿細(xì)胞或過渡型漿細(xì)胞)，也有的呈橢圓形，核偏于一邊（稱為典型漿細(xì)胞)。它們都具有豐富胞漿（HE染色呈紅色)，能產(chǎn)生和分泌各種抗體。一個成熟漿細(xì)胞只能分泌一種抗體。胃腸道粘膜中的各種抗體多由局部抗體產(chǎn)生細(xì)胞所分泌。一般認(rèn)為骨髓的多潛能干細(xì)胞轉(zhuǎn)化成細(xì)胞表面具有IgM和IgD標(biāo)記的成熟B淋巴細(xì)胞后進(jìn)入粘膜層或粘膜下層的散在淋巴濾泡或Peyer斑的生發(fā)中心。胃腸腔內(nèi)抗原通過其靠腔面的M細(xì)胞進(jìn)入粘膜固有層，通過巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞將抗原加工后傳遞至生發(fā)中心，在轉(zhuǎn)化生長因子β(β-trans－forming growth factor, TGF-β)、IL-4、IL-5、γ-IFN和抗原刺激下B淋巴細(xì)胞增殖并轉(zhuǎn)移化成細(xì)胞表面含IgG、IgA、IgE等特異性B淋巴母細(xì)胞，一部分直接分散在固有層，大部分經(jīng)淋巴細(xì)胞再循環(huán)返回胃腸道粘膜，在IL-2和IL-6刺激下轉(zhuǎn)化成抗體產(chǎn)生細(xì)胞，分泌特異抗體，發(fā)揮體液免疫反應(yīng)。因此測定粘膜中抗體產(chǎn)生細(xì)胞的分布對進(jìn)一步認(rèn)識局部體液免疫反應(yīng)與胃腸道疾病的關(guān)系有重要意義。
二、雙標(biāo)記免疫熒光染色
抗體產(chǎn)生細(xì)胞胞漿內(nèi)含有相對多的抗原，故采用直接或間接法免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)可簡化步驟，節(jié) 省時間，降低成本。為了清除組織間彌散的免疫球蛋白，我們在固定前用PBS浸洗，取得良好的效果。用雙標(biāo)記免疫熒光技術(shù)可以在同一張切片上顯示出兩種不同的抗體產(chǎn)生細(xì)胞。
1．組織加工根據(jù)研究目的的內(nèi)窺鏡直視下鉗取胃、小腸或結(jié)腸粘膜。將取得的組織立即放入含4℃，pH7.2、0.01mol/l PBS燒杯內(nèi)攪拌10～18h后直接放入4℃、96%乙醇中固定。在4℃環(huán)境下繼續(xù)脫水和透明，56℃浸蠟和包埋，石蠟塊冰箱保存。組織切片后，37℃溫水展平，載片后干燥，裝干燥盒置于冰箱，可以保存1周左右。4℃脫蠟和脫二甲苯，PBS洗滌后蒸餾水清洗，風(fēng)干待染。
2．熒光素標(biāo)記抗體 異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocynate, FITC)標(biāo)記抗體的具體步驟詳見第三章 。在標(biāo)記絡(luò)丹明B200（lissamine rhodamin B200,RB200)時應(yīng)注意：
（1)PCI5極易吸收水份放出煙霧樣刺激氣體，RB200和丙酮混合后攪拌時也放出有毒的SO2Cl刺激性氣體，故操作時最好在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行。在室外操作時應(yīng)戴口罩。醫(yī)學(xué).全在.線www.med126.com
�。�2)丙酮極易揮發(fā)，一定要在密閉容器（如帶蓋的青霉素瓶)內(nèi)攪拌。吸取丙酮時也要動作迅速。
�。�3)在標(biāo)記過程中，RB200能產(chǎn)生HCl，容易使蛋白變性，必須用較多堿性緩沖液中和。具體步驟是：
�、侔�50mg蛋白需10mg RB200和20mg PCI5的比例分別準(zhǔn)確稱取PCl5和RB200，放入青霉瓶內(nèi)。經(jīng)橡皮塞穿入玻棒拌混合5min。
�、谟梦芪�0.5ml左右丙酮迅速注入瓶內(nèi)，繼續(xù)攪拌5min形成紫褐色溶液（A液)。
�、�1份抗血清（含蛋白10～20mg/ml)用等量或2份0.5mol/l p9.5碳酸緩沖液稀釋后在4℃冰箱內(nèi)用磁力攪拌器邊攪邊加入A液，并用混合液反復(fù)沖洗青霉素瓶內(nèi)的A液，直至干凈為止，然后繼續(xù)攪拌30～60min。
④稱取相當(dāng)于蛋白半量的活性碳加入混合液內(nèi)繼續(xù)攪拌60min后，以4000r/min離心30min除去活性碳。
�、萦�30%～50%飽和硫酸銨鹽析1次，去上清液，沉淀物用少量PBS溶解，過G-25層析柱去除硫酸銨即得RB200標(biāo)記的抗體。
�、轗B200的最大吸收光譜為570。用分光光度計分別測定570nm（RB200)和280nm（蛋白)的讀數(shù)，根據(jù)Wells表算出F/P克分子比值。
⑦效價高的標(biāo)記抗體加0.1% NaN3或硫柳汞（0.1%)數(shù)滴防腐，分裝放置20℃以下可長期保存，4℃～10℃能保存半年左右。
3．染色步驟染色前進(jìn)行對照試驗(yàn)、吸收試驗(yàn)和抑制試驗(yàn)，測定抗體的純度和特異性，同時以瓊脂擴(kuò)散和染色效果確定工作效價。在連續(xù)切片中，用RB200標(biāo)記的IgG稀釋液分別與FITC標(biāo)記的IgA和IgM混合（根據(jù)染色效價，分別以對方為稀釋液)進(jìn)行染色。在37℃溫盒內(nèi)孵育45min，PBS清洗，過一次蒸餾水后風(fēng)干，50%緩沖甘油封片，在冰箱中可保存10天左右。
4．陽性結(jié)果觀察及細(xì)胞計數(shù)用Olympus熒光顯微鏡觀察。選擇BG12激發(fā)濾板和0515抑制濾板可同時觀察兩種熒光。胞漿豐富、明顯綠色熒光、核不著色的細(xì)胞為IgA或IgM產(chǎn)生細(xì)胞；胞漿紅色熒光者為IgG產(chǎn)生細(xì)胞。少數(shù)胞漿黃色熒光的細(xì)胞核呈圓形，位于細(xì)胞中央，可能這些B淋巴母細(xì)胞能產(chǎn)生兩種抗體，也可能是具有共同的輕鏈而引起的交叉反應(yīng)。如果用α、β、γ、μ、δ等重鏈單抗進(jìn)行研究，可以進(jìn)行鑒別。在熒光顯微鏡下數(shù)出組織切片中陽性細(xì)胞總數(shù)（N)，測微器放在目鏡下測出組織切片所占小方格數(shù)（P)。測微器小方格邊長為0.5mm,根據(jù)物鏡放大倍數(shù)（4倍)用公式D=64N/P計算出每平方毫米組織切片中所含細(xì)胞數(shù)。
