PCR操作范例及PCR反應(yīng)體系的組成

　　一、PCR操作范例

　　在一個(gè)典型的PCR反應(yīng)體系中需加入：適宜的緩沖液、微量的模板DNA、4×dNTPs、耐熱性多聚酶、Mg²⁺和兩個(gè)合成的DNA引物。模板DNa 94℃變性1min，引物與模板40～60℃退火1min，72℃延伸2min。在首次循環(huán)前模板預(yù)變性3～5min；在末次循環(huán)后，樣品仍需繼續(xù)延伸3～5min以上，確保擴(kuò)增的DNA為雙鏈DNA。為便于了解PCR反應(yīng)中各成份的組成，加入量和反應(yīng)條件，使人們以此為基礎(chǔ)，對不同的研究對象逐項(xiàng)改變來找到最佳反應(yīng)條件，特列舉Perkin Elmer Cetus公司Gene Amp DNA試劑盒提供的典型反應(yīng)條件供參考。

表22-1 PCR反應(yīng)混合液

　　擴(kuò)增條件：94℃60s,37℃60s,72℃120s,共25～30個(gè)循環(huán)。

　　注：[1]反應(yīng)緩沖液[10×]含：100mmol/l Tris-HCl pH8.3(25℃),

　　15mmol/L KCl, 15mmol/L MgCl₂,

　　0.01%(W/V)明膠（Sigma G2500)

　　[2]酶儲(chǔ)存緩沖液（-20℃)含：50%甘油，100mmol/l KCl,

　　20mmol/L Tris-HCl ph8.0

　　0.1mmol/L EDTA, 1.0mmol/L DTT

　　200μg/ml明膠

　　0.5%吐溫20，0.5% Nonidet P40

　　[3][4]引物，1，2：擴(kuò)增λ-噬菌體基因中500bp的片段

　　引物1序列：7131～7155（5’)-GATGAGTTCGTGTCCGTACAACTGG-(3’)

　　引物2序列：7606～7630（5’)-GGTTATCGAAATCAGCCACAGCGCC-(3’)

　　注意（3’)端有2個(gè)bp互補(bǔ)故易生成50bp的雙體

　　二、PCR反應(yīng)系統(tǒng)的組成

　�。ㄒ�)PCR緩沖液（PCr Buffer)

　　用于PCR的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液見PCR操作范例。于72℃時(shí)，反應(yīng)體系的pH值將下降1個(gè)單位，接近于7.2。二價(jià)陽離子的存在至關(guān)重要，影響PCR的特異性和產(chǎn)量。實(shí)驗(yàn)表明，Mg²⁺優(yōu)于Mn²⁺，而Ca²⁺無任何作用。

　　1．Mg²⁺濃度Mg²⁺的最佳濃度為1.5mmol/L(當(dāng)各種dNTP濃度為200mmol/L時(shí))，但并非對任何一種模板與引物的結(jié)合都是最佳的。首次使用靶序列和引物結(jié)合時(shí)，都要把Mg²⁺濃度調(diào)到最佳，其濃度變化范圍為1～10mmol/L。Mg²⁺過量易生成非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，Mg²⁺不足易使產(chǎn)量降低。醫(yī)學(xué)全在線www.med126.com

　　樣品中存在的較高濃度的螯合劑如EDTA或高濃度帶負(fù)電荷的離子基團(tuán)如磷酸根，會(huì)與Mg²⁺結(jié)合而降低Mg²⁺有效濃度。因此，用作模板的DNA應(yīng)溶于10mmol/l Tris-HCl(pH7.6)0.1mmol/L EDTA中。

　　dNTP含有磷酸根，其濃度變化將影響Mg²⁺的有效濃度。標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系中4×dTNPs的總濃度為0.8mmol/L，低于1.5mmol/L的Mg²⁺濃度。因此，在高濃度DNA及dNTP條件時(shí)，必須相應(yīng)調(diào)整Mg²⁺的濃度。

　　2．Tris -HCl緩沖液在PCR中使用10～50mmol/L的Tris –HCl緩沖液，很少使用其他類型的緩沖液。Tris緩沖液是一種雙極化的離子緩沖液，pKa為8.3(20℃),△pKa為0.021/℃。因此，20mmol/l Tris pH8.3(20℃)時(shí)，在典型的熱循環(huán)條件下，真正的pH值在7.8～6.8之間。

　　3．KCl濃度K⁺濃度在50mmol/L 時(shí)能促進(jìn)引物退火。但現(xiàn)在的研究表明，NaCl濃度在50mmol/L時(shí)，KCl濃度高于50mmol/L將會(huì)抑制Taq酶的活性，少加或不加KCl對PCR結(jié)果沒有太大影響。

　　4．明膠明膠和BSA或非離子型去垢劑具有穩(wěn)定酶的作用。一般用量為100μg/ml，但現(xiàn)在的研究表明，加或不加都能得到良好和PCR結(jié)果，影響不大。

　　5．二甲基亞砜（DMSO)　　在使用Klenow片段進(jìn)行PCR時(shí)DMSO是有用的；加入10%DM－SO有利于減少DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，使（G+C)%含量高的模板易于完全變性，在反應(yīng)體系中加入DMSO使PCR產(chǎn)物直接測序更易進(jìn)行，但超過10%時(shí)會(huì)抑制Taq DNA聚合酶的活性，因此，大多數(shù)并不使用DMSO。

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