第四章 紫外-可見分光光度法
第一節(jié) 概 述
紫外-可見分光光度法（ultraviolet-visible spectrophotometry, UVS)是光學(xué)分析法中一種重要而應(yīng)用廣泛的分析方法。光學(xué)分析法(optical analysis)是建立在電磁輻射與物質(zhì)相互作用基礎(chǔ)上，以電磁輻射為“探針”來探測物質(zhì)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)及含量的一種分析方法。根據(jù)不同的分類依據(jù)主要可分為以下幾類：
1.光譜法和非光譜法 光譜法(spectroscopy)又稱為光譜分析法（spectroscopicanalysis)，是指當(dāng)物質(zhì)與輻射能相互作用時，物質(zhì)內(nèi)部發(fā)生能級躍遷，根據(jù)能級躍遷時產(chǎn)生的輻射能強(qiáng)度隨波長的變化建立的分析方法。光譜法又分為吸收光譜法，發(fā)射光譜法和散射光譜法等基本類型。
非光譜法是指當(dāng)物質(zhì)與輻射能相互作用時，不涉及物質(zhì)內(nèi)部能級的躍遷，即不以光的波長為特征信號，根據(jù)電磁輻射的反射、折射、干涉、衍射和偏振等基本性質(zhì)的變化建立的分析方法。這類方法主要有折射法，旋光法，濁度法，X-射線衍射法等。
2.原子光譜法和分子光譜法 原子光譜法（atomic spectroscopy)是根據(jù)原子核外的電子在不同的電子能級間躍遷產(chǎn)生的原子光譜所建立的分析方法。這類方法主要包括原子發(fā)射光譜法、原子吸收光譜法、原子熒光光譜法以及X-射線熒光光譜法等。
分子光譜法（molecularspectroscopy)是根據(jù)分子中電子能級、振動能級和轉(zhuǎn)動能級的變化產(chǎn)生的分子光譜所建立的分析方法。主要有紅外吸收光譜法、紫外－可見吸收光譜法、分子熒光光譜法、分子磷光光譜法等。
3. 吸收光譜法和發(fā)射光譜法 吸收光譜法(absorptionspectroscopy)是根據(jù)物質(zhì)的分子或原子吸收與其能級躍遷相應(yīng)的能量后由基態(tài)或低能態(tài)躍遷至高能態(tài)產(chǎn)生的吸收光譜所建立的分析方法。這類方法有分子吸收光譜法、原子吸收光譜法、核磁共振波譜法。
發(fā)射光譜法(emissionspectroscopy)是根據(jù)物質(zhì)的分子或原子吸收與其能級躍遷相應(yīng)的能量后由基態(tài)或低能態(tài)躍遷至高能態(tài)，再返回到基態(tài)或低能態(tài)產(chǎn)生的發(fā)射光譜所建立的分析方法。主要有原子發(fā)射光譜法、原子熒光光譜法、X-射線熒光光譜法、分子熒光光譜法、分子磷光光譜法等。
本章介紹的紫外-可見分光光度法是根據(jù)物質(zhì)分子對紫外-可見光譜區(qū)光輻射的吸收特征和吸收程度，對物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析的一種吸收光譜法。在可見光區(qū)（波長400～760nm)測定稱為可見分光光度法，在紫外光區(qū)（波長200～400nm)測定稱為紫外分光光度法。紫外-可見分光光度法測定的靈敏度和準(zhǔn)確度高，儀器結(jié)構(gòu)較為簡單，操作方便，快速可靠，易于掌握和推廣，因而它是預(yù)防醫(yī)學(xué)、衛(wèi)生檢驗、醫(yī)學(xué)檢驗、臨床醫(yī)學(xué)、藥物分析、食品分析、環(huán)境保護(hù)等部門廣泛采用的一種儀器分析方法。
為了更好地理解各種光學(xué)分析法，下面將對電磁輻射及其與物質(zhì)的相互作用作簡要介紹。
第二節(jié) 電磁輻射及其與物質(zhì)的相互作用
一、電磁輻射與電磁波譜
光是一種電磁輻射(electromagnetic radiation)，又稱電磁波，是一種以巨大速度通過空間傳播的光量子流。它的基本單位是光子，光子具有微觀粒子的波動性和粒子性，即波粒二象性。
光子的能量與頻率或波長的關(guān)系：
（4-1)
式中，E 為光子的能量，單位為焦耳（J)或電子伏特（eV)；h 為Plank常數(shù)，數(shù)值為6.626×10-34焦耳秒（J·s)；ν為頻率（赫茲,Hz)；c為光速，在真空中其值為2.998×1010厘米/秒（cm/s)；
式4-1中，h和c均為常數(shù)，因此，光子的能量與頻率成正比，與波長成反比。
電磁輻射按波長順序排列稱為電磁波譜（electromagnetic spectrum)。電磁波譜包括的波長范圍很寬，表4-1列出了波長0.005nm～1000m的波譜區(qū)域。
表4-1 電磁波譜
| 輻射類型 | 波長范圍 | 光譜類型 | 躍遷類型 |
| γ射線 | 0.005～0.14nm | γ射線光譜 | 核能級 |
| X射線 | 0.01～10nm | X射線光譜 | 內(nèi)層電子能級 |
| 遠(yuǎn)紫外光 近紫外光 可見光 近紅外光 中紅外光 遠(yuǎn)紅外光 微波 無線電波 | 10～200nm 200～400nm 400～760nm 0.76～2.5μm 2.5～50μm 50～1000μm 0.1～100cm 1～1000m | 真空紫外光譜 紫外光譜 可見光譜 紅外光譜 紅外光譜 紅外光譜 微波波譜 核磁共振波譜 | 內(nèi)層電子能級 原子及分子的價電子或成鍵電子能級 原子及分子的價電子或成鍵電子能級 分子振動能級 分子振動能級和轉(zhuǎn)動能級 分子轉(zhuǎn)動能級 分子轉(zhuǎn)動能級和電子自旋能級 磁場誘導(dǎo)核自旋能級 |
二、電磁輻射與物質(zhì)的相互作用
電磁輻射與物質(zhì)的相互作用是普遍發(fā)生的比較復(fù)雜的物理現(xiàn)象，有涉及物質(zhì)內(nèi)能變化的吸收、熒光與磷光發(fā)射和拉曼散射等，以及不涉及物質(zhì)內(nèi)能變化的透射、折射、非拉曼散射、衍射和旋光等。
當(dāng)輻射通過固體、液體或氣體等透明介質(zhì)時，電磁輻射的交變電場導(dǎo)致分子（或原子)的外層電子相對其核的振蕩，致使這些分子（或原子)周期性的極化。若入射的電磁輻射能量正好與介質(zhì)分子（或原子)基態(tài)與激發(fā)態(tài)之間的能量差相等，介質(zhì)分子（或原子)就會選擇性吸收這部分輻射能，從基態(tài)躍遷至激發(fā)態(tài)，然后以熱或光等形式釋放出能量，回到基態(tài)。以光的形式釋放出能量的過程稱為發(fā)射。
若入射的電磁輻射能量與介質(zhì)分子（或原子)基態(tài)與激發(fā)態(tài)之間的能量差不相等，則電磁輻射不被吸收，分子（或原子)極化所需的能量僅被介質(zhì)分子（或原子)瞬間（10-14～10-15s)保留，然后被再發(fā)射，從而產(chǎn)生光的透射、非拉曼光譜、反射、折射等物理現(xiàn)象。光從介質(zhì)A照射到介質(zhì)B的界面時，一部分光在界面上改變方向返回到介質(zhì)A，稱為光的反射；另一部分光則改變方向，以一定的折射角度進(jìn)入介質(zhì)B，此現(xiàn)象稱為光的折射。在一定條件下光波會發(fā)生相互作用，當(dāng)其疊加時，將產(chǎn)生一個強(qiáng)度視各波的相位而定的加強(qiáng)或者減弱的合成波，稱為干涉。當(dāng)兩個波長的相位差180º時，則發(fā)生相消干涉；若兩個波的相位相同時，則發(fā)生最大相長干涉。當(dāng)光波通過狹縫或繞過障礙物時，將以約180º的角度向外輻射，波前進(jìn)的方向則發(fā)生彎曲，此現(xiàn)象稱為衍射。光的散射是指光子與介質(zhì)分子之間發(fā)生彈性碰撞，在碰撞時沒有能量交換，光的頻率不變，但光子的運動方向則發(fā)生改變。而拉曼散射是由光子與介質(zhì)分子之間發(fā)生了非彈性碰撞所致，碰撞時光子不僅改變了運動方向，而且還有能量交換，光的頻率也發(fā)生了變化。
第三節(jié) 分子吸收光譜
一、分子吸收光譜的產(chǎn)生
當(dāng)輻射通過氣態(tài)、液態(tài)或固態(tài)物質(zhì)時，物質(zhì)的分子對輻射進(jìn)行選擇性的吸收，從而產(chǎn)生分子吸收光譜。
物質(zhì)分子內(nèi)部有三種運動狀態(tài)：電子繞原子核作相對運動、分子內(nèi)原子在其平衡位置上振動、分子作為整體繞軸轉(zhuǎn)動。三種運動狀態(tài)對應(yīng)于三種能級，分別稱為電子能級、振動能級和轉(zhuǎn)動能級。每一個電子能級中有若干個振動能級,用V =0,1,2,3…表示;每一個振動能級中有若干個轉(zhuǎn)動能級,用J =0,1,2,3…表示。雙原子分子的三種能級躍遷示意圖如圖4-1所示。
圖4-1 雙原子分子的三種能級及其躍遷示意圖
光的吸收是物質(zhì)與輻射相互作用的一種形式，物質(zhì)分子只能吸收能量等于其兩個能級差△E的光子，分子吸收光能之后,受激發(fā)將從原來能量最低的能級(基態(tài)能級)躍遷到能量較高的能級(激發(fā)態(tài)能級)。
（4-2)
式中E1為分子基態(tài)的能量；E2為分子激發(fā)態(tài)的能量。由于光子的能量決定于頻率,是量子化的,所以分子只能選擇吸收能量與其能級間隔相一致的光子。
分子轉(zhuǎn)動能級間的能量差最小,為0.005～0.05eV(對應(yīng)光子的波長250～25mm),相當(dāng)于遠(yuǎn)紅外的能量。因此,分子發(fā)生轉(zhuǎn)動能級躍遷時所產(chǎn)生的吸收光譜稱為轉(zhuǎn)動光譜或遠(yuǎn)紅外光譜。
分子振動能級間的能量差約為0.05～1eV(相應(yīng)波長25～1.25mm)。因此振動能級躍遷所產(chǎn)生的吸收光譜稱為振動光譜或紅外光譜。由于發(fā)生振動能級躍遷時同時伴有轉(zhuǎn)動能級的躍遷，故振動光譜實質(zhì)上是振動-轉(zhuǎn)動光譜。
分子中電子能級間的能量差約為1～20eV(相應(yīng)波長1.25～0.06mm)。因此由電子能級躍遷而產(chǎn)生的吸收光譜稱為電子光譜或紫外-可見吸收光譜。在分子發(fā)生電子能級躍遷時同時伴隨著振動能級和轉(zhuǎn)動能級的躍遷,所以電子光譜實m.zxtf.net.cn/wsj/際上是電子－振動－轉(zhuǎn)動光譜。這種光譜是由一系列譜線連成的譜帶,稱為帶狀光譜,它比原子的線狀光譜復(fù)雜得多。
由于各種物質(zhì)分子的內(nèi)部結(jié)構(gòu)不同，且發(fā)生能級躍遷時吸收光能具有量子化的特征, 故物質(zhì)對光的吸收具有選擇性。
二、分子吸收光譜及其特征
測定某一溶液對不同波長單色光的吸光度（吸光度的定義見本章第四節(jié))，然后以波長為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪圖,所描繪的圖形稱為吸收光譜(absorption spectrum)，又稱為吸收曲線(absorption curve)，如圖4－2所示。吸光度最大處所對應(yīng)的波長稱為最大吸收波長（maximum absorption wavelength ,
圖4-2 吸收曲線示意圖
三、紫外-可見吸收光譜的主要類型
（一)有機(jī)化合物的電子躍遷和吸收帶類型
許多有機(jī)化合物吸收紫外－可見光輻射后發(fā)生電子能級躍遷，產(chǎn)生吸收帶。當(dāng)有機(jī)化合物吸收了紫外或可見光以后，分子中單鍵的s電子、雙鍵中的p電子和O、N、X或S等雜原子上未成鍵的孤對電子即n電子都有可能躍遷到各自能級較高的s*或p*反鍵軌道上去，圖4-3為分子中價電子能級及躍遷示意圖。
圖4-3 分子中價電子能級及躍遷示意圖
有機(jī)化合物分子中電子躍遷通常有四種類型，各種躍遷所需能量的大小順序為：
s®s*>n®s*>p®p*>n®p*
1.s®s*躍遷 即分子中的電子從s軌道躍遷到s*軌道上的躍遷。實現(xiàn)s®s*躍遷所需的能量最大，所吸收的輻射波長一般小于150nm, 位于遠(yuǎn)紫外區(qū)。一般不討論由s®s*躍遷所引起的吸收譜帶。
2.n®s*躍遷 即電子從n軌道躍遷到s*軌道上的躍遷。含有非成鍵n電子的雜原子（如-OH、-NH2、-X等基團(tuán))的飽和烴衍生物，都會發(fā)生這種躍遷。實現(xiàn)n®s*躍遷所需的能量比s®s*躍遷的小，最大吸收波長一般在稍低于200nm的區(qū)域內(nèi),在紫外區(qū)仍不易觀察到這類躍遷。
3.p®p*躍遷 即電子從p軌道躍遷到p*軌道上。這種躍遷所需的能量比n®s*的稍小些，孤立的p®p*躍遷的最大吸收波長一般也在200nm附近。p®p*躍遷的能量隨著p-p共軛程度的增大而減少，如丁二烯分子p®p*躍遷所需的能量比乙烯分子p®p*躍遷所需的能量少。共軛雙鍵中p®p*躍遷所產(chǎn)生的吸收帶稱為K帶，其主要特點是摩爾吸光系數(shù)值一般大于104，為強(qiáng)帶。如丁二烯的λmax為217nm, 摩爾吸光系數(shù)值為2.1×104，屬于K帶。
4.n®p*躍遷 即電子從n軌道躍遷到p*軌道上。實現(xiàn)n®π*躍遷所需的能量最小，因此，其最大吸收波長一般在近紫外區(qū)。含有雜原子的重鍵化合物（含
＞C=O，－C≡N等)都會發(fā)生這類躍遷。由n®p*躍遷引起的吸收帶稱為R帶，它的主要特點是吸收弱，其摩爾吸光系數(shù)值一般在100以內(nèi)。
在四類躍遷中，p®p*、n®p*躍遷所需能量在紫外或可見光區(qū)，吸收的波長可用紫外及可見分光光度計測定。p®p*躍遷與n®p*躍遷有兩個重要差別：第一，摩爾吸光系數(shù)不同。p®p*躍遷的摩爾吸光系數(shù)很大，單個不飽和鍵的摩爾吸光系數(shù)在104左右；而n®p*躍遷的摩爾吸光系數(shù)很小，一般在10～100范圍內(nèi)。第二，溶劑的極性對這兩種躍遷吸收峰波長影響不同。當(dāng)溶劑的極性增加時，p®p*躍遷所產(chǎn)生的吸收峰（K帶)向長波長移動，稱長移（紅移)；而n®p*躍遷所產(chǎn)生的吸收峰（R帶)隨溶劑的極性增加則向短波長移動，稱短移（藍(lán)移或紫移)。因為在p®p*躍遷的情況下，激發(fā)態(tài)的極性比基態(tài)的強(qiáng)，極性溶劑使激發(fā)態(tài)p*的能量比p的能量降低的多，p®p*躍遷就容易，因而使吸收峰紅移。而在n®p*躍遷中，非成鍵n電子在基態(tài)時與極性溶劑容易形成穩(wěn)定的氫鍵，引起n軌道能量降低，使躍遷時需能量多則變得不易發(fā)生，從而使吸收峰藍(lán)移。另外，當(dāng)R帶受到附近的強(qiáng)吸收峰影響時，R帶有時發(fā)生紅移，有時則被掩蓋。這種溶劑效應(yīng)提示，在有機(jī)化合物的紫外吸收光譜測定中，應(yīng)根據(jù)具體情況選擇適當(dāng)?shù)娜軇�。常用的溶劑有己烷、庚烷、環(huán)己烷、乙醇和水等。
（二)無機(jī)化合物中主要的電子躍遷及吸收帶類型
1.配位場躍遷 指在配體的配位場作用下，鑭系和錒系元素能量相等的f軌道或過渡金屬元素能量相等的d軌道分裂成能量不等的f軌道或d軌道，在光能激發(fā)下低能態(tài)f電子或d電子躍遷到高能態(tài)的f軌道或d軌道上的躍遷，產(chǎn)生配位場吸收帶。此類躍遷吸收峰波長受配位體的影響比較大，摩爾吸光系數(shù)一般小于102。
2．電荷遷移躍遷 指金屬配合物中電子從配位體（電子給予體)的軌道躍遷到中心離子（電子接受體)的軌道上的躍遷，產(chǎn)生電荷遷移吸收帶。此類躍遷的摩爾吸光系數(shù)一般大于104，測定靈敏度高，常常利用電荷遷移躍遷產(chǎn)生的吸收測定金屬離子的含量。
四、有機(jī)化合物的紫外吸收光譜
1.飽和碳?xì)浠衔?飽和碳?xì)浠衔镏挥笑译娮?只能發(fā)生σ®σ*躍遷,吸收峰在遠(yuǎn)紫外區(qū)，在紫外吸收光譜分析中常用作溶劑。
2.含孤立生色團(tuán)或助色團(tuán)的飽和化合物 生色團(tuán)是指有機(jī)化合物分子結(jié)構(gòu)中含有π®π*或n®π*躍遷、能在紫外可見光區(qū)產(chǎn)生吸收的原子團(tuán)，如＞C=C＜、＞C=0、-N=N-、-NO2、＞C=S等。助色團(tuán)是指能使飽和碳?xì)浠衔锘蛏珗F(tuán)的吸收峰藍(lán)移、吸收程度增加的含有非鍵n電子的雜原子飽和基團(tuán)，如-OH、-NH2、-OR、-SH、-Cl、-Br、-I等。
飽和碳?xì)浠衔锏臍浔簧珗F(tuán)或助色團(tuán)取代后，分子內(nèi)會產(chǎn)生n®σ*、n®π*、π®π*躍遷，吸收峰一般移至近紫外區(qū)。
3.共軛烯烴 分子中有共軛雙鍵時,π®π*能級間隔變小,吸收峰長移,吸收增強(qiáng)。共軛體系越大,π®π*躍遷能量越小,紅移越明顯,摩爾吸光系數(shù)越大。
4.α、β不飽和醛、酮 α、β不飽和醛、酮分子中，羰基與C=C雙鍵共軛，π®π*躍遷時吸收峰在200～260nm，n®π*躍遷時吸收峰在310～350nm。
5.芳香族化合物 芳香族化合物中最簡單的是苯，苯具有環(huán)狀共軛體系，發(fā)生π®π*躍遷。苯環(huán)上引入助色團(tuán)或生色團(tuán)時，則發(fā)生π®π*和n®π*躍遷，有多個吸收峰，吸收峰發(fā)生紅移。苯環(huán)上取代基增多時，共軛體系增大，吸收峰紅移更加明顯。
利用有機(jī)化合物的紫外吸收光譜特征可初步推斷有機(jī)化合物的分子骨架、官能團(tuán)及共軛體系中取代基的種類、數(shù)目、位置等，在有機(jī)化合物的結(jié)構(gòu)研究方面有一定的作用。
第四節(jié) 光的吸收定律
一、光的吸收定律
當(dāng)一束平行的單色光通過吸收池中的溶液時，光的一部分被溶液吸收，一部分透過溶液，還有一部分被吸收池表面反射。設(shè)入射光強(qiáng)度為
（4-3)
在分光光度法測定時，先用空白溶液調(diào)零,再測定樣品溶液,吸收池的質(zhì)量和厚度都相同,因而
（4-4)
透過光強(qiáng)度與入射光強(qiáng)度之比，稱為透光度（transmittance)或透光率，用
透光度也常用
朗伯（Lambert)研究發(fā)現(xiàn)，在濃度c一定的條件下，溶液對單色光的吸收程度（吸光度)與液層的厚度b成正比，即朗伯定律，數(shù)學(xué)表達(dá)式為
(4-6)
式中
比爾(Beer)研究發(fā)現(xiàn)，在厚度b一定的條件下，溶液對單色光的吸收程度與其濃度c成正比，即比爾定律，數(shù)學(xué)表達(dá)式為
(4-7)
若同時考慮溶液的厚度b和濃度c，即把朗伯定律與比爾定律合并，得到朗伯-比爾定律（Lambert-Beer’slaw)，結(jié)合式4-5，則有
(4-8)
朗伯-比爾定律可表述為：當(dāng)一束平行的單色光通過溶液時，溶液的吸光度與溶液的濃度及液層厚度的乘積成正比。它是光吸收的基本定律，是分光光度法定量分析的依據(jù)。
式4-8中，
當(dāng)濃度
（4-9)
摩爾吸光系數(shù)ε與吸光物質(zhì)的性質(zhì)、入射光波長、溶劑等因素有關(guān)。①物質(zhì)性質(zhì)不同，ε值大小不同；②溶劑不同，同種物質(zhì)的ε值不同，使用時需指明溶劑；③入射光波長不同，ε值不同，應(yīng)用時需指明波長。
在定量分析中則用ε值評價方法的靈敏度，ε值愈大，表示測定的靈敏度愈高。因此，在分析工作中，常通過選擇實驗條件以使吸光物質(zhì)的ε值盡可能的大，以獲得盡可能高的測定靈敏度。某一物質(zhì)的ε值，則是通過測定適當(dāng)?shù)蜐舛热芤旱奈舛群�，代入式�?-9)計算得到。
當(dāng)濃度
(4-10)
根據(jù)a與 的定義及物質(zhì)的量濃度和質(zhì)量濃度之間的關(guān)系可推導(dǎo)得：
式中,M為吸光物質(zhì)的摩爾質(zhì)量，單位為g/mol。
二、影響光吸收定律的因素
對于均勻體系，當(dāng)溶液的厚度一定時，溶液的吸光度與吸光物質(zhì)的濃度成正比，以吸光度A為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度c為橫坐標(biāo)作圖，得到的直線稱為標(biāo)準(zhǔn)曲線（standard curve)。但實驗發(fā)現(xiàn)，溶液濃度只有在適當(dāng)?shù)偷姆秶鷷r，A與c才成良好的線性關(guān)系。當(dāng)溶液濃度較高時，標(biāo)準(zhǔn)曲線則發(fā)生彎曲，即偏離光吸收定律，如圖4-4所示。
圖4-4 吸光度與濃度的關(guān)系
影響光吸收定律的因素有多種，可歸納為兩大類，即測定的試樣因素和儀器因素:
1.與儀器有關(guān)的因素 儀器（分光光度計)的性能會影響光源的穩(wěn)定性、入射光的單色性等。
（1)非單色光的影響 光吸收定律只有在入射光為單色光的情況下才能成立。但分光光度計的光源經(jīng)單色器分光時，由于單色器分辨率的限制及儀器的狹縫必須保持一定的寬度才能得到足夠的光強(qiáng)度，因此，由單色器獲得的光并不是嚴(yán)格的單色光，而是包含一定波長范圍的有限寬度的譜帶，是以l0（中心吸收波長) 為中心的一狹窄波長范圍的復(fù)合光。對于帶寬為△的單色光，測得的吸光度一般小于l0處的真實吸光度值，產(chǎn)生負(fù)偏離。
（2)雜散光的影響 雜散光是指與所需波長相隔較遠(yuǎn)而不在譜帶寬度范圍內(nèi)的光。雜散光的產(chǎn)生一般是由儀器元件的瑕疵或受塵埃污染及霉蝕所引起。若待測溶液吸收雜散光，產(chǎn)生正偏離；若待測溶液不吸收雜散光，則產(chǎn)生負(fù)偏離。
2.與試樣溶液有關(guān)的因素
（1)溶液濃度的影響 當(dāng)溶液處于高濃度時，吸光物質(zhì)分子或離子間的平均距離縮小，使相鄰吸光分子或離子之間的電荷分布互相影響，從而改變了它們對光的吸收能力，使吸光度與濃度之間的線性關(guān)系發(fā)生改變。
（2)體系（介質(zhì))不均勻的影響 當(dāng)待測溶液為膠體溶液、乳濁液或懸浮液時，入射光通過溶液后，除了一部分光被待測物質(zhì)吸收之外，還會有少部分光因折射、散射或反射而改變方向被損失掉，從而使透過光的強(qiáng)度減弱，實測的吸光度增加；當(dāng)懸濁液發(fā)生沉淀時，又會使透過光強(qiáng)度增加，吸光度減少。這些情況都會導(dǎo)致偏離吸收定律。
（3)化學(xué)因素的影響 光吸收定律推導(dǎo)的基本假設(shè)之一，是試液中各組分沒有相互作用。在吸光度測定中，溶液中的化學(xué)反應(yīng)，如吸光物質(zhì)發(fā)生離解、締合、互變異構(gòu)、配位或配合物組成變化等，都可改變其濃度，從而導(dǎo)致偏離光吸收定律。例如亞甲藍(lán)陽離子單體的吸收峰為660nm，二聚體的吸收峰為610nm，隨著濃度的增加，二聚體的吸收峰增強(qiáng)，單體的吸收峰則減弱。顯然，亞甲藍(lán)陽離子濃度不同，離解為單體與締合為二聚體的情況不同，吸光度與濃度則不成線性關(guān)系。
第五節(jié) 分光光度計
一、分光光度計的主要部件
紫外-可見分光光度計(ultraviolet-visiblespectrophotometer)的基本組成可分為光源、單色器、吸收池、檢測器、顯示系統(tǒng)等五個部分，基本結(jié)構(gòu)如方框圖所示：
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1.光源(light source) 光源是提供入射光的裝置。理想的光源應(yīng)在廣泛的光譜區(qū)域內(nèi)發(fā)射連續(xù)光譜，具有足夠的強(qiáng)度和良好的穩(wěn)定性；在整個光譜區(qū)域內(nèi)光的強(qiáng)度不隨波長的變化而有明顯的變化。但是，實際上幾乎所有的光源其光強(qiáng)度都隨波長的改變而改變。為了使投射到吸收池上光的強(qiáng)度在各個波長時都能保持一致，通常在分光光度計內(nèi)裝有光強(qiáng)度補償裝置。
分光光度計常用的光源有兩類：即白熾光源（熱光源)如鎢絲燈及碘鎢燈；以及氣體放電光源如氫弧燈（簡稱氫燈)和重氫燈（即氘燈)。
鎢燈或碘鎢燈能發(fā)射出350～2500nm波長范圍的連續(xù)光譜，最適宜的使用范圍是360～1000nm，所以它是可見分光光度計的光源。電源電壓對發(fā)光強(qiáng)度影響很大，為了保持光源發(fā)光穩(wěn)定，通常采用穩(wěn)壓裝置來穩(wěn)定電源電壓。
氫燈或氘燈能發(fā)射出150～400nm波長范圍的連續(xù)光譜，是紫外分光光度計的光源。在相同操作條件下，重氫燈的光強(qiáng)度比氫燈約大四倍。由于玻璃能吸收紫外線，所以氫燈燈泡及窗口用石英材料制成。為使輸出的光強(qiáng)穩(wěn)定，也要有穩(wěn)壓裝置。
2.單色器(monochromator) 單色器是將來自光源的光按波長的順序分散為單色光并能隨意調(diào)節(jié)波長的一種裝置，是分光光度計的核心部件。單色器的主要組成部分是：
(1)入口狹縫 其作用是限制雜散光進(jìn)入。
(2)出口狹縫 其作用是讓色散后所需波長的光通過。
(3)色散元件 其作用是把混合光分散為單色光，是單色器的關(guān)鍵部分。常用的色散元件有三角棱鏡和光柵。
1)棱鏡 棱鏡由玻璃或石英材料制成。對一般的棱鏡材料，折射率（
式中
2)光柵 光柵有多種，光譜儀器中多采用平面反射光柵。它由高度拋光的表面上刻劃的許多根平行線槽所組成。有600條/mm、1200條/mm、2800條/mm等。當(dāng)復(fù)合光照射到光柵上面，光柵的每條刻線都產(chǎn)生衍射作用，而每條刻線所衍射的光又會相互干涉產(chǎn)生干涉條紋。不同波長的入射光產(chǎn)生的干涉條紋的衍射角不同，波長長的衍射角大，波長短的衍射角小，從而使復(fù)合光色散成按波長順序排列的單色光。光柵色散性能比棱鏡優(yōu)越，光柵的色散基本是線性的，即在不同的波段范圍，波長差相等的光被分開的距離基本相同，而棱鏡的色散是非線性的。
(4)準(zhǔn)直鏡 它的作用是將來自入口狹縫的發(fā)散光變成平行光，并把來自色散元件的平行光聚焦于出口狹縫。
3.吸收池(absorption cell) 用以盛裝被測溶液。常用的吸收池是用無色、耐腐蝕的玻璃或石英材料制成，其中兩面透明，兩面為毛玻璃。前者用于可見光區(qū)，后者用于紫外光區(qū)。在定量分析中，所用吸收池須經(jīng)過挑選。挑選方法一般是將同一厚度的一組吸收池裝同一種空白溶液，于所選用波長下測定其透光度，透光度之差應(yīng)小于0.5%。
4.檢測器(detector) 它的作用是檢測通過溶液后的光信號強(qiáng)度，并把光信號轉(zhuǎn)變成電信號。檢測器有光電管、光電倍增管、陣列型光電檢測器。
(1)光電管 管內(nèi)裝有一個陽極和一個陰極，如圖4-5所示。陽極為金屬電極，通常用鎳制成；陰極是一個金屬半圓筒，其凹面涂有一層對光敏感的堿金屬或堿金屬氧化物或二者的混合物。管內(nèi)抽真空或抽真空后充入少量惰性氣體。當(dāng)光照射到光敏陰極時，陰極發(fā)射出電子，電子受到具有高正電位的陽極吸引，產(chǎn)生電流。光愈強(qiáng)，發(fā)射的電子愈多，電流就愈大。產(chǎn)生的電流通過負(fù)載電阻
圖4-5 光電管線路示意圖
(2)光電倍增管 光電倍增管內(nèi)裝有一個涂有光敏金屬的陰極和一個具有高正電位的陽極，另外管內(nèi)還設(shè)有幾個倍增光敏陰極，即二次發(fā)射極（又稱打拿極)，一般設(shè)有9個倍增極。圖4-6為光電倍增管及電路示意圖。
圖4-6 光電倍增管及電路示意圖
當(dāng)光照射到陰極上時，陰極即發(fā)射光電子。這些光電子在電場加速下，轟擊到第一倍增極上，每一個光電子可使該倍增極發(fā)射出許多額外次級光電子，這些次級光電子又被加速轟擊到第二個倍增極上，使第二倍增極又發(fā)射出更多新的光電子。這個過程繼續(xù)重復(fù)下去，直到最后一個倍增極。最終這些經(jīng)倍增了的電子被集中到陽極上去，產(chǎn)生較強(qiáng)的電流。由于所產(chǎn)生的電子流每經(jīng)過一個倍增極便被放大一次，因此這種光電管稱為光電倍增管。但是，光電倍增管測強(qiáng)光時，光電流與光強(qiáng)度不成直線關(guān)系，并且陰極和倍增極容易疲勞，使靈敏度下降。
光電倍增管的放大倍數(shù)，主要取決于電極間的電壓。電壓越高，放大倍數(shù)就越大。所產(chǎn)生的電流從陽極輸出，經(jīng)過負(fù)載電阻
（3)陣列型光電檢測器 近年來光學(xué)多道檢測器如光二極管陣列檢測器已經(jīng)裝配到紫外－可見分光光度計上。光二極管陣列是在晶體硅上緊密排列一系列光二極管，每個二極管相當(dāng)于一個單色儀的出口狹縫。兩個二極管中心距離的波長單位稱為采樣間隔，因此在二極管陣列分光光度計中，二極管數(shù)目愈多，分辨率愈高。有的陣列型光電檢測器由1024個二極管組成陣列，在極短的時間可在190～820nm范圍內(nèi)獲得全光光譜。
5.顯示系統(tǒng)(display system) 顯示系統(tǒng)是將檢測器輸出的信號經(jīng)處理轉(zhuǎn)換成透光度和吸光度再顯示出來。顯示方式有表頭顯示、數(shù)字顯示等。有些儀器可直接讀取濃度，配有計算機(jī)的可進(jìn)行測定條件設(shè)置、數(shù)據(jù)處理、結(jié)果顯示及打印。
二、分光光度計的類型
分光光度計的分類方法有多種，若按波長類別分，有單波長分光光度計和雙波長分光光度計；按光束類別分，有單光束分光光度計和雙光束分光光度計；按工作波長范圍分，有可見分光光度計、紫外及可見分光光度計、紅外分光光度計。
1.單波長單光束分光光度計 此種光度計從單色器出來的一束單色光進(jìn)入吸收池后，透射出來的光進(jìn)入檢測器被檢測，所得的電信號經(jīng)放大后由指示器指示出來。
常用的721型分光光度計屬于單波長單光束型，其光學(xué)系統(tǒng)示意圖如圖4-7所示。
圖4-7 721型分光光度計光學(xué)系統(tǒng)示意圖
由光源發(fā)射的連續(xù)光，經(jīng)聚光透鏡和平面反射鏡轉(zhuǎn)900后再經(jīng)入口狹縫進(jìn)入單色器內(nèi)，狹縫正好位于準(zhǔn)直鏡的焦平面上，照射到準(zhǔn)直鏡上的入射光被準(zhǔn)直鏡反射后變成一束平行光射到背面鍍鋁的棱鏡上被色散，由棱鏡色散后出來的光線再經(jīng)準(zhǔn)直徑的反射，會聚于出口狹縫上，進(jìn)入吸收池后，其透過光照射到光電管上產(chǎn)生電流，經(jīng)放大后由顯示系統(tǒng)讀數(shù)。
722型光柵分光光度計采用鎢鹵素?zé)糇鞴庠�，光柵作色散元件，�?shù)字顯示，該儀器不僅可讀取
751G型分光光度計是紫外及可見分光光度計，其光學(xué)系統(tǒng)示意圖如圖4-8所示。通過左右擺動燈箱內(nèi)的凹面反射鏡，可以使來自鎢燈或氫燈的連續(xù)光射到平面反射鏡上，再被平面鏡反射至入口狹縫而進(jìn)入單色器內(nèi)。其它光路與721型分光光度計類似。儀器設(shè)有氫燈和鎢燈兩種光源燈，進(jìn)行紫外吸收光譜測定時，用氫燈作光源，用GD-5紫敏光電管（適用波長范圍200～625nm)作受光器；進(jìn)行可見吸收光譜測定時，則用鎢燈作光源，用GD-6紅敏光電管（適用波長范圍625～1000nm)作受光器。該儀器的狹縫在0～2.0mm范圍內(nèi)可調(diào)。
圖4-8 751G型分光光度計光學(xué)系統(tǒng)示意圖
752型光柵分光光度計其光源與751G相同，它采用光柵作色散元件，用國產(chǎn)端窗式多堿陰極光電管（適用波長范圍190～860nm)作受光器，故能在紫外及可見光譜區(qū)域內(nèi)進(jìn)行檢測。采用數(shù)字顯示，并可以直讀濃度值。
2.單波長雙光束分光光度計 此類光度計的工作原理如圖4-9所示。由圖看出，從單色器出來的光強(qiáng)度為I0的一束單色光通過切光器（也叫斬波器)分解為兩束強(qiáng)度相同的光束，交替通過參比池
圖4-9 單波長雙光束裝置示意圖
與單光束分光光度計比較，雙光束分光光度計具有不受光源瞬間波動影響的優(yōu)點。推導(dǎo)說明如下：
設(shè)有光源發(fā)出的入射光強(qiáng)度為
根據(jù)朗伯-比爾定律
設(shè) 則
（4-11)
式中消去了I0，可見，光源的瞬間波動不影響A值。
3.雙波長分光光度計 雙波長分光光度計裝有兩個單色器，光源發(fā)出的光分別由兩個單色器得到兩個波長的單色光。一般的雙波長分光光度計，既能以雙波長單光束方式工作，也能夠以單波長雙光束方式工作。
雙波長分光光度計的工作原理如圖4-10所示。由光源發(fā)出的光分兩路進(jìn)入第一單色器和第二單色器，色散后射出兩束不同波長的單色光
圖4-10 雙波長分光光度計光學(xué)系統(tǒng)示意圖
雙波長分光光度計以單波長雙光束方式工作的原理如圖4-11所示。來自光源的光有一束被光閘檔光板檔住，不能進(jìn)入單色器，只有一束光進(jìn)入單色器，經(jīng)色散后，一束光強(qiáng)度為
圖4-11 雙波長分光光度計以單波長雙光束方式工作的光學(xué)系統(tǒng)示意圖
采用雙波長分光光度法，通過適當(dāng)選擇兩個波長，可以對吸收光譜相互重疊的混合物分別定量，也可測定背景吸收較大的樣品，提高了測定的選擇性，擴(kuò)大了分光光度法的應(yīng)用范圍。
第六節(jié) 分光光度法反應(yīng)條件和測量條件的選擇
進(jìn)行可見分光光度法測定時，由于大多數(shù)物質(zhì)吸光系數(shù)都很小，難以直接測定，必須先用適當(dāng)?shù)脑噭┡c試樣中的待測組分反應(yīng)，把它轉(zhuǎn)變成吸光系數(shù)較大的有色化合物，然后進(jìn)行測定。這種使待測組分轉(zhuǎn)變成有色化合物的反應(yīng)，叫做顯色反應(yīng)，所用的試劑稱為顯色劑。顯色反應(yīng)的優(yōu)劣對分析測定的靈敏度及準(zhǔn)確度有很大影響。另外，為了得到較好的測量靈敏度和準(zhǔn)確度，也必須注意選擇適宜的測量條件。
一、顯色反應(yīng)及其條件的選擇
（一)顯色反應(yīng)及要求
1．顯色反應(yīng) 顯色反應(yīng)的類型有配位（絡(luò)合)反應(yīng)、偶合反應(yīng)、氧化還原反應(yīng)等，其中配位（絡(luò)合)反應(yīng)應(yīng)用較廣。
2．顯色反應(yīng)的要求：
（1)待測組分應(yīng)定量地轉(zhuǎn)變成有色化合物，二者有確定的化學(xué)計量關(guān)系。
（2)反應(yīng)生成的有色化合物的組成恒定、穩(wěn)定，符合一定的化學(xué)式，且摩爾吸光系數(shù)要大（應(yīng)在104以上)以使測量的靈敏度高、重現(xiàn)性好、誤差小。
（3)有色化合物與顯色劑的顏色要有明顯的差別，即顯色劑的emax與生成物的emax差別要大。這樣顯色時的試劑空白值較小。
（4)反應(yīng)選擇性好，干擾少，或干擾易消除。
（二)顯色反應(yīng)條件的選擇
影響顯色反應(yīng)的因素比較多，如顯色劑用量、溶液酸度、顯色溫度、顯色時間、共存離子的干擾等，在選擇好反應(yīng)體系后，要對影響因素進(jìn)行試驗，通過試驗確定顯色反應(yīng)條件。
1．顯色劑的用量 顯色劑與待測組分轉(zhuǎn)變成有色化合物的顯色反應(yīng)可表示如下：
（待測組分) （顯色劑) （有色化合物)
上述反應(yīng)在一定程度上是可逆的。為了保證反應(yīng)盡可能地進(jìn)行完全，必須加入過量的顯色劑。但有時過量太多，會使配合物組成改變，導(dǎo)致顏色減退，對測定不利。例如，用顯色劑SCN-來測定Mo5+時，
淺紅色 橙紅色 淺紅色
當(dāng)SCN-適量時生成橙紅色的Mo（SCN)5，若SCN-過量太多，就會生成淺紅色的Mo（SCN)6-，使吸光度降低。有些干擾物質(zhì)在顯色劑過量太多時，就會與其產(chǎn)生副反應(yīng)，干擾測定。此外，不少顯色劑本身帶有顏色，若用量過多，常使空白值增大。
顯色劑用量可通過實驗確定。圖4-12為吸光度與顯色劑加入量的關(guān)系。由圖可以看出，用量在X1ml至X2ml之間比較適宜，因為此時的吸光度值較大且已達(dá)到恒定。
圖4-12 吸光度與顯色劑加入量的關(guān)系
2．溶液的酸度 pH值對顯色反應(yīng)的影響表現(xiàn)在下面幾個方面：
（1)對顯色劑顏色的影響：不少有機(jī)顯色劑本身就是酸堿指示劑，在不同的酸度下具有不同的顏色，產(chǎn)生不同的吸收。要選擇合適的pH值以使顯色劑不干擾測定。
（2)對顯色反應(yīng)的影響：不少顯色劑是有機(jī)弱酸或弱堿，它們在水溶液中有微弱的離解。顯色劑（HR)的離解平衡與顯色反應(yīng)之間的關(guān)系如下：
顯然，當(dāng)[H+]增大時，使平衡向形成HR的方向移動，導(dǎo)致[R-]降低，促進(jìn)有色化合物MR離解，從而影響顯色反應(yīng)。當(dāng)[H+]太小時，在某些情況下會引起配合物的組成改變，導(dǎo)致配合物的顏色改變，產(chǎn)生不同的吸收。例如，F(xiàn)e3+與磺基水楊酸（用SS表示)的反應(yīng)，當(dāng)pH為1.8～2.5時，可生成紫紅色的[Fe(SS)]+；當(dāng)pH為4～8時，生成橙紅色的[Fe(SS)2]-；當(dāng)pH為8～11.5時，生成黃色的[Fe(SS)3]3-；當(dāng)pH>12時，將生成Fe(OH)3沉淀而影響有色配合物的生成。
（3)對金屬離子存在狀態(tài)的影響：大部分高價金屬離子如Fe3+、Al3+、Th4+、Bi3+等都容易水解。當(dāng)溶液的pH較高時，會析出沉淀或產(chǎn)生羥基配合物，從而使金屬離子濃度降低，影響測定。
因此，在顯色反應(yīng)中，控制溶液的酸度十分重要。而某一顯色反應(yīng)適宜的酸度應(yīng)通過實驗來確定。方法是固定溶液中待測組分和顯色劑的濃度，在不同的pH條件下進(jìn)行顯色，分別測定溶液的吸光度，作
3．顯色溫度 一般顯色反應(yīng)在室溫下就能迅速進(jìn)行完全，而有的顯色反應(yīng)需要加熱至一定的溫度才能完成反應(yīng)。合適的顯色溫度必須通過實驗來確定，繪制
4．顯色時間 各種顯色反應(yīng)速度不同，各有色化合物的穩(wěn)定性也不同，顯色溶液達(dá)到色調(diào)穩(wěn)定、吸光度最大所需的時間有長有短，因此，必須通過實驗確定適宜的顯色時間。其方法是配制一份顯色溶液，從加入顯色劑開始計時，每隔幾分鐘測定一次吸光度，然后繪制
5．干擾的消除 分光光度法測定的樣品組成一般比較復(fù)雜，樣品溶液中的共存離子若本身有顏色，或它能與顯色劑生成有色化合物等都將對測定帶來干擾。干擾的消除方法主要有：
（1)加入掩蔽劑，使其與干擾離子生成無色配合物以消除干擾。例如，用丁二酮肟測定鎳時，可用檸檬酸作掩蔽劑以消除鐵的干擾。
（2)加入氧化劑或還原劑，使其與干擾離子發(fā)生反應(yīng)從而改變干擾離子價態(tài)以消除干擾。例如，用鉻天青S測定鋁時Fe3+干擾，可加入抗壞血酸使Fe3+還原為Fe2+消除干擾。
（3)選擇適宜的顯色條件，如控制溶液的酸度，使干擾離子不與顯色劑作用而消除干擾。例如執(zhí)業(yè)醫(yī)師，用磺基水揚酸測定Fe3+時，Cu2+與試劑生成黃色配合物則干擾測定。但控制pH在2.5左右，Cu2+則不與試劑顯色，從而消除Cu2+的干擾。
（4)分離干擾離子，若采取上述幾種方法不能消除干擾時，可采用沉淀或溶劑萃取等分離方法以消除干擾。
此外，溶劑有時對顯色反應(yīng)也有影響，應(yīng)根據(jù)具體情況，選擇適宜的溶劑，以提高顯色反應(yīng)的靈敏度或顯色速度。
二、測定條件的選擇
（一)測量波長的選擇
一般是根據(jù)待測組分的吸收光譜,選擇最大吸收波長lmax作為測量波長。因為在
（二)吸光度讀數(shù)范圍的選擇
任何分光光度計都有一定的測量誤差，即光度誤差。光度誤差是指讀數(shù)誤差為單位百分透光度（即)時所引起的濃度相對誤差（
)。在不同吸光度范圍內(nèi),讀數(shù)所引起的光度誤差的大小不同。因此,應(yīng)在光度誤差較小的范圍內(nèi)讀數(shù)。光度誤差可由光吸收定律導(dǎo)出：
根據(jù)光的吸收定律
（4-12 )
微分得
以有限值表示 （4-13)
式4-13除以式4-12得
即濃度相對誤差為 （4-14)
式4-14中，不相同。設(shè)
時,根據(jù)式4-14可計算出不同
，所得數(shù)據(jù)列于表4-2中。
表4-2 不同(假定
)
| T% | 95 | 90 | 80 | 70 | 65 | 60 | 50 | 36.8 | 30 | 20 | 15 | 10 | 5 |
| A | 0.022 | 0.046 | 0.100 | 0.155 | 0.188 | 0.222 | 0.301 | 0.434 | 0.523 | 0.699 | 0.823 | 1.000 | 1.301 |
|
| 20.5 | 10.5 | 5.6 | 4.0 | 3.6 | 3.3 | 2.9 | 2.7 | 2.8 | 3.1 | 3.5 | 4.3 | 6.7 |
* (%) 數(shù)值前的 ± 號從略。
將對T%作圖得一曲線，如圖4- 13所示。
圖4-13 相對誤差與百分透光度的關(guān)系
由表4-2和圖4-13 可以看出，。為得到較高的測量準(zhǔn)確度,A應(yīng)在0.2～0.8范圍內(nèi)讀數(shù)。在實際分析時,可通過控制溶液的濃度及選擇適當(dāng)厚度的吸收池使
3.空白溶液的選擇 空白溶液(blank solution)也稱參比溶液(reference solution)。測量試液的吸光度時,先用參比溶液調(diào)節(jié)透光度為100%,以消除溶液中其它成組分、吸收池和溶劑對入射光的反射和吸收所帶來的誤差。
空白溶液有下列幾種,必須根據(jù)試樣的不同進(jìn)行選擇。
（1)溶劑空白 當(dāng)溶液中只有待測組分在測定波長下有吸收,而其它組分均無吸收時,可用純?nèi)軇┳鲄⒈热芤?稱為“溶劑空白”。
（2)試劑空白 如果除待測組分外,顯色劑和其它試劑在測定條件下也有吸收時,則取與測定試液時所用的顯色劑和其它試劑作為參比溶液(只是不加待測組分),稱為“試劑空白”。
（3)試樣空白 如果只是試樣基體有色,而顯色劑無色,并且也不與試樣基體顯色時,則用不加顯色劑的試樣溶液作為參比溶液,稱為“試樣空白”。
（4)平行操作空白 為了抵消在分析過程中引入的干擾物質(zhì)的影響，可用不含待測組分的試樣或溶劑或蒸餾水按照與試液完全相同的分析步驟進(jìn)行平行操作,然后以所得的溶液作為參比溶液,稱為“平行操作空白”。也常以其它空白溶液為參比溶液,測定出平行操作空白溶液的值,常稱空白值,計算時從試液的測定值中再減去這個空白值。
第七節(jié) 定性及定量分析方法
一、定性分析
利用紫外-可見分光光度法對有機(jī)化合物進(jìn)行定性分析時，需將待測試樣和標(biāo)準(zhǔn)品用相同的溶劑配成濃度相近的溶液，以相同的條件分別測定它們的吸收光譜，然后比較兩者吸收光譜圖的一些特征，如：吸收峰數(shù)目和形狀、最大吸收波長、摩爾吸光系數(shù)等,若兩者非常一致,就可以基本上認(rèn)為它們是同一種物質(zhì)。如果得不到標(biāo)準(zhǔn)品,也可以與文獻(xiàn)上的標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行對照、比較，但要注意其測定條件必須一致。
需要說明的是有機(jī)化合物的紫外吸收光譜的吸收帶寬而平坦，并且數(shù)目也不多，利用紫外-可見分光光度法對化合物進(jìn)行定性分析時有一定局限性。當(dāng)有機(jī)化合物的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)相近時，它們的吸收光譜非常相似甚至相同；即使它們的結(jié)構(gòu)有差異，但分子中含有相同的生色團(tuán)時，吸收光譜的形狀基本相同。所以當(dāng)吸收光譜相同時，也有可能不是同一種化合物，此時需借助其他方法進(jìn)一步鑒別證實。若兩個化合物吸收光譜不同時，則可以肯定這兩個化合物不是同一種化合物。
二、純度檢測
根據(jù)吸收曲線的特征可檢查樣品中有無雜質(zhì)。如果待測物質(zhì)在紫外及可見光區(qū)沒有明顯吸收,而雜質(zhì)有吸收,那么根據(jù)吸收曲線可檢查出雜質(zhì)。例如,若乙醇或環(huán)己烷中含有雜質(zhì)苯,苯在256nm處有吸收峰,而乙醇或環(huán)己烷則無吸收,因此,若樣品在256nm處有吸收峰時說明樣品含有雜質(zhì)苯。
另外,根據(jù)摩爾吸光系數(shù)也可檢查有無雜質(zhì)。若待測物質(zhì)有較強(qiáng)的吸收而所含雜質(zhì)在此波長下基本無吸收,雜質(zhì)的存在將使待測物質(zhì)的摩爾吸光系數(shù)降低,反之亦然。
三、定量分析
紫外-可見分光光度法主要用于定量分析，定量依據(jù)是Lambert-Beer定律。方法有：
1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線法 配制一系列（5～7個)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在待測物質(zhì)的
用同樣方法配制待測試樣的溶液，在相同條件下測定其吸光度
2. 直接比較法 在相同條件下配制標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測試樣溶液，濃度宜相近，以減少誤差。然后分別測定它們的吸光度。根據(jù)吸收定律：
因K
（3-15)
此法比較簡便，但誤差較大。分析時使cs與cx盡可能的接近，以提高測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。
3. 雙波長分光光度法 對于多組分混合物的定量分析，若組分的吸收峰相互重疊，采用單波長單光束或單波長雙光束分光光度法測定時，處理結(jié)果時必須解聯(lián)立方程式，比較麻煩費時，誤差也比較大。對于成分復(fù)雜、背景吸收較大的試樣溶液，單波長分光光度法則無法測定。而雙波長分光光度法可以同時測定多組分的混合物，不需解聯(lián)立方程式，也可以測定背景吸收較大的溶液。雙波長分光光度法定量分析的理論依據(jù)如下：
在雙波長分光光度法中，開始時，使交替照射到吸收池的兩束波長分別為
(4-16)
式中ε1及
式4-16表明,ΔA與溶液中待測組分的濃度
用雙波長分光光度法對兩個組分混合物中某個組分的測定,常采用等吸收點法消除干擾。等吸收點法是指在干擾組分的吸收光譜上,選兩個適當(dāng)?shù)牟ㄩLλ1和
選擇
以測定阿司匹林中水楊酸的含量為例說明等吸收點法。先分別測定阿司匹林(d)和水楊酸(e)在純品狀態(tài)時吸收光譜,如圖4-14所示, 曲線S表示混合物的吸收光譜。在干擾組分阿司匹林的吸收曲線d上選定有利于測定的兩個等吸光度的波長
混合物在
混合物在
上式說明,水楊酸在
如果要測定阿司匹林的含量，則把水楊酸作為干擾組分，這時必須在水楊酸的曲線上另行選擇有利于測定的兩個等吸光度的波長
圖4-14 兩組分混合物吸收光譜用作圖法選擇
4.導(dǎo)數(shù)光譜法 導(dǎo)數(shù)光譜法(derivative spectroscopy)是解決干擾物質(zhì)與待測物質(zhì)的吸收光譜互相重疊，消除膠體和懸浮物散射影響和背景吸收的良好定量方法。
（1)基本原理：根據(jù)吸收光譜的數(shù)據(jù)，每隔一個波長小間隔Δ的值。
（4-17)
圖13-14 吸收光譜（a)及其導(dǎo)數(shù)光譜(b-e)～λ曲線，得到的圖形為一階導(dǎo)數(shù)光譜。依次可求出高一階的導(dǎo)數(shù)光譜，利用帶有微處理機(jī)的分光光度計可以直接描繪出吸收光譜及其一階和高階導(dǎo)數(shù)光譜。以高斯曲線模擬的吸收光譜（稱零階光譜)及其一至四階的導(dǎo)數(shù)光譜如圖4-15所示。利用導(dǎo)
數(shù)光譜對組分進(jìn)行定性、定量分析的方法稱為導(dǎo)數(shù)光譜法。此法尤其在多組分的同時測定、渾濁溶液測定、背景干擾消除及復(fù)雜光譜的辨析等方面具有獨特的優(yōu)越性。
圖4-15 吸收光譜（a)與導(dǎo)數(shù)光譜(b～e)
根據(jù)導(dǎo)數(shù)的物理意義及圖4-15可知，在吸收光譜的極大點處，其奇數(shù)階時導(dǎo)數(shù)為零，而偶數(shù)階時導(dǎo)數(shù)為極值；在吸收曲線的拐點處，其奇數(shù)階導(dǎo)數(shù)為極大或極小，而偶數(shù)階導(dǎo)數(shù)為零。隨著導(dǎo)數(shù)階數(shù)的增加，峰數(shù)增加，峰寬度變窄，分辨能力提高，有利于重疊譜帶及肩峰的分離和鑒別。
導(dǎo)數(shù)光譜法的定量依據(jù)，根據(jù)Lambert-Beer定律得：
（4-18)
由式（4-18)可知，在一定條件下，吸光度A的n階導(dǎo)數(shù)值與待測組分的濃度c成正比。
(2)導(dǎo)數(shù)光譜法定量數(shù)據(jù)的測量:從導(dǎo)數(shù)光譜上選擇適宜的導(dǎo)數(shù)信號，通常采用幾何法測量出定量所需的數(shù)據(jù)。常用的測量方法有峰-谷法、基線法和峰-零法，如圖4-16所示。
圖4-16導(dǎo)數(shù)光譜法定量數(shù)據(jù)測量法
1) 峰-谷法 在導(dǎo)數(shù)光譜上測量峰與相鄰谷之間的距離，該值與待測組分的濃度成正比，如圖4-16中a、c所示。此法靈敏度高，較為常用。
2) 基線法 該法又稱正切法。在導(dǎo)數(shù)光譜上對兩個相鄰峰作切線，然后測量切線到兩峰之間的谷的距離，該值與待測組分的濃度成正比，如圖4-16中b所示。
3) 峰-零法 在導(dǎo)數(shù)光譜上測量峰至基線間的距離，該值與待測組分的濃度成正比，如圖4-16中d所示。
第八節(jié) 催化動力學(xué)分光光度法
催化動力學(xué)分光光度法(spectrophotometry by catalytickinetics)是以催化反應(yīng)為基礎(chǔ)，通過測定催化體系中反應(yīng)物或產(chǎn)物的吸光度
一、指示反應(yīng)與指示物質(zhì)
對于一個化學(xué)反應(yīng)，其反應(yīng)速率依賴于催化劑（或抑制劑)的濃度，若利用此反應(yīng)可以測定催化劑（或抑制劑)的量，這種化學(xué)反應(yīng)稱為指示反應(yīng)。指示反應(yīng)中的反應(yīng)物和生成物稱為指示物質(zhì)。如碘離子催化Ce(Ⅳ)氧化As(Ⅲ)生成Ce(Ⅲ)和As(Ⅴ)的反應(yīng)，此反應(yīng)可以測定催化劑碘離子的量，該反應(yīng)稱為碘離子的指示反應(yīng)，Ce(Ⅳ)、As(Ⅲ)、Ce(Ⅲ)和As(Ⅴ)均為指示物質(zhì)。催化動力學(xué)分光光度法最常用的指示反應(yīng)是氧化還原反應(yīng)。常用的氧化劑為H2O2、Ce(Ⅳ)、鹵酸鹽,還原劑多為有機(jī)化合物，催化劑為金屬離子。
二、定量依據(jù)
設(shè)一顯色反應(yīng)的反應(yīng)速率較慢，在催化劑的催化下速度加快，其催化顯色反應(yīng)為：
若選擇產(chǎn)物F為指示物質(zhì)，根據(jù)質(zhì)量作用定律，速率方程為
(4-19)
式中cA、cB
控制實驗條件，使
（4-20)
積分后得
（4-21)
產(chǎn)物F的吸光度與其濃度c催符合Lambert-Beer定律，即
代入式（4-21)得
（4-22)
在實驗條件一定時，ε、b為常數(shù)，與
（4-23)
式（4-23)即為催化動力學(xué)分光光度法的定量依據(jù)。
三、定量方法
在具體測定時，常采用固定時間法，此時式（4-23)中
（4-24)
顯然，A與c催成線性關(guān)系。催化動力學(xué)分光光度法多采用快速冷卻終止指示反應(yīng)，標(biāo)準(zhǔn)溶液及待測溶液均在同樣的時間內(nèi)進(jìn)行，通過工作曲線法求出待測物質(zhì)
第九節(jié) 提高分析靈敏度和準(zhǔn)確度的方法
提高分析的靈敏度和準(zhǔn)確度的方法主要有示差分光光度法、萃取分光光度法、膠束增溶分光光度法等，介紹如下：
一、示差分光光度法
普通分光光度法用于高濃度或很稀溶液的測定時，因吸光度值太大或太小，超出了適宜的吸光度讀數(shù)范圍而引入較大的光度誤差。若用示差分光光度法（簡稱示差法),由于擴(kuò)展了讀數(shù)標(biāo)尺,因而提高了測定的靈敏度和準(zhǔn)確度,減少了誤差。示差法可分為高濃度示差法、低濃度示差法和最精密示差法三種。高濃度示差法的原理如下：
以比待測溶液濃度（
后式減去前式得
(b為一定值)(4-25)
顯然,△A與△
圖4-17 高濃度示差法標(biāo)尺擴(kuò)展原理圖
二、萃取分光光度法
萃取分光光度法是溶劑萃取與分光光度法相結(jié)合的一種分析方法。本法先將待測組分的配合物用有機(jī)溶劑萃取,然后在萃取后的有機(jī)相中進(jìn)行分光光度測定。萃取對待測組分具有富集作用,還可消除干擾離子,使分離和測定在較簡單的一些操作步驟中結(jié)合進(jìn)行,在一定程度上加快了分析速度,提高了方法的靈敏度和選擇性。
三、膠束增溶分光光度法
研究發(fā)現(xiàn),在二元配合物中加入某些長碳鏈的季胺鹽或烷基吡啶鹽、聚乙稀醇等表面活性劑,可與金屬離子以及顯色劑形成三元膠束狀配合物。由于這種季胺鹽的長碳鏈具有疏水性,而季胺鹽分子之間又存在吸引力,因此,在水溶液中逐漸聚集成為幾十個分子組成的膠體質(zhì)點,稱為膠束。膠束能使原來溶解度較小的物質(zhì)在溶劑中的溶解度增加。同時,膠束還可促進(jìn)高配位數(shù)的三元膠狀配合物的生成,新生成的膠狀三元配合物的吸收峰常發(fā)生紅移,從而使測定的靈敏度顯著提高。另外，還可以改變pH對配合物的影響，使顯色反應(yīng)的pH范圍變寬，條件易于控制，這種借助表面活性劑的膠束增溶作用,而以分光光度法測定金屬離子的方法,稱為膠束增溶分光光度法。
分析化學(xué)中常用的表面活性劑有氯化十六烷基三甲銨(CTMAC)、溴化十六烷基三甲銨(CTMAB)、溴化十六烷基吡啶（CPB)、溴化十四烷基吡啶(TPB)、溴化羥十六烷基三甲銨(CTM)等。
第十節(jié) 紫外-可見分光光度法的應(yīng)用示例
紫外-可見分光光度法在醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域中應(yīng)用相當(dāng)廣泛，如用于大氣、飲水、食品、藥物、生物材料等樣品的分析等。下面介紹幾個有關(guān)定量分析的實例：
一、二硫腙法測定尿中微量鎘
鎘不是人體必需的微量元素，嬰兒出生時體內(nèi)并沒有鎘，以后從空氣、飲水和食物中攝入微量鎘。有文獻(xiàn)報道，人體內(nèi)鎘的總含量約有30mg，其中三分之一積于腎臟。健康人尿液每升中含鎘量少于12.7mg。接觸鎘化合物者,尿液及血液中鎘含量增加,在急性鎘中毒時,鎘含量可顯著增加。尿液和血液中鎘含量的檢測,可以作為鎘中毒參考數(shù)據(jù)之一。
常用二硫腙法測定鎘離子。將尿液標(biāo)本處理后,于堿性溶液中應(yīng)用二硫腙三氯甲烷溶液與鎘離子反應(yīng),生成紅色二硫腙鎘配合物。二硫腙鎘不溶于水,可溶于三氯甲烷中,故用三氯甲烷萃取后在有機(jī)相中進(jìn)行分光光度法測定。lmax=520nm, ε=8.56×104。用本法測定尿鎘干擾較少，但應(yīng)嚴(yán)格控制溶液酸度，從反應(yīng)式中可以看出，酸性增強(qiáng)，將促進(jìn)配合物離解，影響測定結(jié)果。
二、苯酚的分光光度法測定
苯酚俗稱石炭酸，具有揮發(fā)性和腐蝕性。苯酚能以蒸氣和液體形式經(jīng)呼吸道、皮膚、粘膜侵入機(jī)體；另外，酚是蛋白質(zhì)在機(jī)體內(nèi)代謝的產(chǎn)物。因此，無論在血液或尿中都有酚的存在。據(jù)有關(guān)資料報道，接觸苯者尿中苯酚含量增高，故測定尿中苯酚含量對評價苯吸收有一定參考價值。
苯酚可溶于在近紫外區(qū)不產(chǎn)生吸收的飽和烴、醇、醚等有機(jī)溶劑，因此，可借助這些有機(jī)溶劑把苯酚從水溶液中萃取出來，進(jìn)行分光光度法測定，lmax=272nm。
苯酚也可采用4—氨基安替比林可見分光光度法進(jìn)行測定，其原理為：
苯酚與4-氨基安替比林在堿性（pH=8～10)介質(zhì)中與氧化劑鐵氰化鉀作用，生成的紅色安替比林染料，可用其水溶液直接進(jìn)行分光光度測定，或者用三氯甲烷萃取后再進(jìn)行分光光度測定（lmax =460nm )。
三、分光光度法測定人血清或尿中的無機(jī)磷
正常人血及尿中均含有無機(jī)磷。血清中無機(jī)磷（簡稱血清磷)正常值成人為0.79～1.61mmol/L,兒童為1.45～2.10mmol/L。尿中無機(jī)磷(簡稱尿磷)正常值為16.13～41.94mol/L 24h。若患有甲狀旁腺功能減退、腎功能衰竭,則血清磷增高而尿磷降低；若患有甲狀旁腺功能亢進(jìn)、腎小管變性病變,則血清磷降低而尿磷增高。故測定血清磷或尿磷,在臨床上具有重要意義。測定原理為：
血清或尿樣經(jīng)三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)后而得的無蛋白濾液中加入鉬酸銨試劑時,無蛋白濾液中的無機(jī)磷與鉬酸銨[Mo（VI)]反應(yīng),生成磷鉬酸銨。用氨基酚磺酸還原磷鉬酸銨,生成一種鉬(V)雜多酸類的“鉬藍(lán)”。
7 PO43- +12 (NH4)6Mo7O24 + 36 H2O→7(NH4)3PO4·12 MoO3 + 51 NH4＋+ 7 H2O
(NH4)3PO4·12MoO3 + 氨基酚磺酸還原溶液 → Mo(V) 雜多酸 (藍(lán)色)
溶液中藍(lán)色的雜多酸可用分光光度法在波長為690 nm下進(jìn)行測定，從而計算出血清或尿液中無機(jī)磷含量。
（張洪權(quán) 吳擁軍)
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