實用免疫細胞與核酸:第一節(jié)　在細菌學中的應用

免疫細胞化學在細菌學中主要用于菌種鑒定和抗原結構的研究。細胞都各自有其特異性抗原，應用特異性抗體的熒光素或酶標記物，可以鑒定任何一種細菌。已經(jīng)成功地用于鑒定幾乎所有致病菌的純培養(yǎng)。尤其是應用免疫熒光技術具有較其他血清學方法簡便、快速和敏感等優(yōu)點，并能直接進行細菌形態(tài)觀察�？捎糜阼b定的材料也比較多樣，如培養(yǎng)物、感染組織、病人分泌排泄物，外環(huán)境中采集材料（土壤、水、雜物等)。由于此法對某些傳染病原能較常規(guī)方法作出更快速的診斷，因而具有特殊意義。

免疫細胞化學方法用于研究細菌抗原結構和形態(tài)學觀察，由于單克隆抗體的應用，比其他方法更為有效。

圖16-1　免疫熒光在病原細菌診斷程序中的應用時機

從患者咽部粘膜用棉拭子取標本，作涂片用甲組溶血性鏈球菌熒光抗體染色，能夠很快作出診斷。對于痢疾桿菌、霍亂孤菌、布氏桿菌、炭疽桿菌和腦膜炎雙球菌、肺炎雙球菌等的實驗診斷均有較好的效果（如表16-1)。

利用間接免疫熒光或酶標記抗體法，檢測患者血清中的抗體更有價值，廣泛用于臨床診斷和流行病學研究。

表16-1 免疫熒光細胞化學方法在細菌診斷中的應用評價

（引自，黃策：免疫熒光和熒光免疫。1983)

一、甲組溶血性鏈球菌的快速檢查法

（一)試劑制備

用抗甲組溶血性鏈球菌的抗體，以FITC標記，制成熒光抗體，再用C和G鏈球菌充分吸收；或用抗I型鏈球菌M蛋白成分的血清，標記后吸收，都有可靠的特異性。

（二)檢查方法

（1)以棉拭子擦拭患者咽部粘膜，取標本。

（2)將拭子浸入1ml肉湯小試管內(nèi)，37℃培養(yǎng)2～3h。

（3)取出棉拭了作分離培養(yǎng)，常規(guī)鑒定。將肉湯液離心3～4min,3000r/min,棄上清，沉淀加0.01mol/l Ph7.2 PBS 洗滌，再離心沉淀，棄上清。

（4)以沉淀涂片，直徑約1cm,涂兩個圓形區(qū)。

（5)將標本m.zxtf.net.cn/yishi/放入95%酒精中固定1min，然后浸入PBS中洗1次，取出室溫晾干。

（6)直接法染色，左側標本作對照，加非溶血性鏈球菌熒光抗體染色。右側加甲組溶血性鏈球菌熒光抗體染色。置濕盒中孵育20～30min，再用PBS洗2次，每次5min，振動洗滌，濾紙吸干標本周圍的水。

（7)加緩沖甘油封裱，立即熒光顯微鏡觀察。

免疫熒光檢出的陽性率較培養(yǎng)法為高，因為前者可以檢出抗菌素治療后的死菌。二者符合率達95%。

二、腦膜炎雙球菌的快速檢查法

（一)制備熒光抗體

可用多價和I、II、III、IV型單價的腦膜炎球菌抗血清，分別制備多價和單價熒光抗體。

（二)檢查方法

用患者咽拭子，腦脊液或培養(yǎng)標本制備涂片，晾干，火焰或乙醇固定，37^℃中染色30min，熒光顯微鏡檢查。

抗腦膜炎雙球菌的熒光抗體有很高的特異性，可以快速檢出和鑒定腦膜炎雙球菌。有人應用免疫熒光檢查267例腦膜炎病人腦脊液中腦膜炎雙球菌，陽性率73.4%，培養(yǎng)和普通染色則只分別為41.9%和34.4%。

三、霍亂弧菌和副霍亂弧菌的快速檢查法

霍亂和副霍亂是嚴重的傳染病，快速診斷才能及早防治。取病人糞便標本直接涂片熒光抗體染色檢查，與常規(guī)培養(yǎng)法比較，具有快速特異和檢出率很高的優(yōu)點。尤其適用于急性期病人的診斷。

四、鼠疫桿菌的快速檢查法

鼠疫是烈性傳染病，快速及時的診斷對于控制流行和救治病人有決定性意義，免疫熒光快速診斷方法是一種特異和敏感的手段。直接法和間接都可應用，以直接法更簡便。

五、炭疽桿菌的快速檢查法

炭疽也是一種烈性傳染病，早期快速診斷對救治病人有決定性意義。免疫熒光檢查方法對炭疽桿菌的檢出率很高。應用抗夾膜熒光抗體檢查炭疽桿菌有十分確定的診斷意義。也可用間接法檢測血清中抗夾膜抗體。

六、致病性大腸桿菌的快速檢查法

（1)制備當?shù)爻Ｒ姷闹虏⌒源竽c桿菌熒光抗體。

（2)取病人大便標本或直腸拭子以生理鹽水攪和涂片，晾干，火焰固定。

（3)直接法免疫熒光染色，立即熒光顯微鏡檢查。

由于本菌較其他非致病性大腸桿菌組有特殊的抗原，不易發(fā)生強交叉反應。所以，在兒童腸炎和引起人群暴發(fā)性腸炎時更準確、快速和簡便。

七、結核桿菌的快速診斷方法

結核桿菌感染機體后可以誘導產(chǎn)生抗體，可用間接法檢查血、胸腹水和腦脊液中的抗體。

也可用抗結核桿菌的熒光抗體直接法檢查抗原。

八、其他細菌的快速檢查方法

對軍團桿菌、布氏桿菌、土拉桿菌、產(chǎn)氣夾膜桿菌等的快速診斷，效果良好。

九、鉤端螺旋體的檢查法

（1)根據(jù)當?shù)劂^端螺旋體的型別制備多價抗體、標記FITC制成熒光抗體。

（2)檢查方法：

①血液標本的檢查：取發(fā)熱期的病人或發(fā)病動物的血液約2ml，制取血漿，并加入鉀明礬（0.058g/ml)，振蕩混勻后置室溫10～15min，然后中速離心沉淀，取沉渣涂片，晾干，95%酒精固定。免疫熒光染色，鏡檢。

②尿液標本檢查：取病人或動物尿液約2～3ml，高速離心，取沉渣涂片，無水乙醇固定，免疫熒光染色，鏡檢。

③臟器標本的檢查：取發(fā)病動物的腎臟皮質(zhì)部分，以刀片切出整齊斷面，濾紙吸去血液，再以潔凈載玻片壓印制片，晾干后以丙酮在4℃固定。經(jīng)10%甲醛固定的組織可作冰凍切片，依丙酮-乙醇-甲醇的次序固定，熒光抗體染色前以3%表面活性劑如Tween20處理切片，據(jù)稱，這樣可使熒光強度增加4倍。

④培養(yǎng)液檢查：同尿處理。

⑤特異性抗體的檢查：用適當血清型的鉤端螺旋體作抗原，用間接法檢查病人血清中的特異性抗體，可用于流行病學調(diào)查和臨床追溯診斷。此檢查適用于人類和家畜等。

本法診斷鉤端螺旋體，一般只具有屬的特異性，鑒定抗體則可能達到型的特異性。

十、梅毒螺旋體的檢查法

免疫熒光細胞化學應用于梅毒血清學診斷有很多文獻報道。70年代應用PAP法又將敏感性提高了許多倍，此法已作為梅毒診斷的常規(guī)方法。用間接免疫熒光法可PAP法，取已知梅毒螺旋體作抗原，檢查病人血清中的特異性抗體。

（一)抗原制備

以標準株（如Nicol株)梅毒螺旋體感染家兔睪丸，約1周后待睪丸產(chǎn)生明顯炎癥，剖腹將睪丸摘除，仔細清除精索、附睪和包膜，然后以滅菌器械將其剪成薄片，置于燒瓶內(nèi)，加入20ml生理鹽水，振蕩30min，使螺旋體逸出，2000r/min離心10min以除去組織碎塊和血細胞，將上清高速離心（10,000r/min)30min，去上清，沉淀以5ml生理鹽水洗滌，再高速離心，洗滌，反復3次以上，以盡可能除去組織成分和家兔球蛋白，最后以pH7.2PBS(內(nèi)含0.01%硫柳汞或數(shù)滴福爾馬林以防腐)將沉淀制成敏感毫升約含10，000，000螺旋體的懸液，置4℃保存?zhèn)溆�。有效期約半年。

（二)熒光抗體

用抗人IgG和IgM熒光抗體。為診斷新生兒先天性梅毒，必須用抗人IgM熒光抗體。

所有稀釋用PBS 0.1mol/L Na₂HPO₄-KH₂PO₄,0.15mol/lNaCl Ph7.2含1%Tween-80。

（三)間接免疫熒光染色方法（FIA試驗)

1．定性檢查先將待檢血清滅活。在載玻片上以白金耳取抗原液涂片，每片涂4個點，在室溫中晾干，丙酮固定10min。各點分別加－1：50稀釋待檢血清；②－1：200稀釋陽性血清；③－1：50稀釋陰性血清；④－PBS。放入濕盒，在37^℃或室溫中放置20min，用PBS振蕩洗滌10min，再加適當稀釋的抗人IgG和IgM熒光抗體，再同上條件下放置20min，水洗，封裱，鏡檢。結果如①、②熒光陽性，③、④陰性，待檢血清即判斷為陽性。陽性時梅毒螺旋體呈明亮的黃綠色熒光，亦有人將待檢血清稀釋m.zxtf.net.cn/rencai/1：200作定性檢查，這樣可排除低稀釋時正常人可出現(xiàn)的假陽性反應，此法又稱FTA-200試驗。

2．滴度測定如定性檢查陽性，則被檢血清應進一步稀釋成1：100，1：200，1：400，1：800，1：1600……以定出染色滴度，滴度疑點以螺旋體發(fā)“++”熒光為標準。

（四)熒光梅毒螺旋體抗體吸收試驗（Fluorescent treponemal antibody – absorption Test 簡稱FTA－ABS)

FTA-200試驗敏感性較差，有時查不出潛伏期和晚期梅毒。FTA－ABC試驗不但敏感性高，而且特異性更好。方法是將非致病性螺旋體Reiter株的培養(yǎng)液于121℃高壓加熱10min，然后高速離心、沉淀，取其上清浸液作為吸附劑，并用以稀釋病人血清（1：5)，然后如上法（FTA試驗)進行染色檢查。

FTA-ABC所用的反復洗滌過的純梅毒螺旋體抗原，推薦置1.0%清蛋白、0.0375mol/l葡萄糖、0.01mol/L二氯化鎂和0.85%氯化鈉溶液（用0.1mol/L磷酸鉀緩沖液pH6.8配制)中冰凍干燥保存，其中清蛋白起保護劑的作用，葡萄糖可增加折光率，二氯化鎂維持螺旋體的形態(tài)學，緩沖液穩(wěn)定pH。

（五)梅毒螺旋體的直接檢查法

取梅毒局部硬結滲出液涂片，用直接法或間接法免疫細胞化學染色，更容易發(fā)現(xiàn)隱藏在細胞碎片之間的螺旋體。免疫熒光檢出效果和暗視野檢一樣敏感。如用RB200標記牛清蛋白作初染色，圖像更為清晰。