病理學(xué)理論與實驗教學(xué)-電子教材:病理學(xué)常用新技術(shù)原理及應(yīng)用

圖18-3食管鱗癌 E-cad膜強陽性   圖18-4 神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞GFAP胞漿胞膜陽性  圖18-5肺硬化性血管瘤 TIF-1核陽性

陰性對照

（１)空白對照：用ＰＢＳ置換第一抗體；

（２)血清替代對照：用同種動物的正常血清代替第一抗體；

（３)抑制對照：用未標(biāo)m.zxtf.net.cn/zhuyuan/記的抗體先和相應(yīng)的抗原結(jié)合；

（４)吸收對照：用純化的抗原對抗體先行吸收；

陽性對照：用已知或已被實驗證明為陽性的組織；

自身對照：利用組織切片內(nèi)的各種不同的組織成分作對照。 

2．假陽性反應(yīng)：

⑴ 非特異性反應(yīng)：邊緣現(xiàn)象、皺折和刀痕、出血和壞死等；

⑵ 內(nèi)源性過氧化物酶：紅細(xì)胞、炎細(xì)胞、退變壞死細(xì)胞和某些腺上皮分泌物，以及某些富含過氧化物酶的組織，如腦、肝等；

⑶ 抗體的交叉反應(yīng)：抗體本身含有與人體組織發(fā)生交叉反應(yīng)的成分；  

⑷ 試劑濃度過高或失效。

3．假陰性反應(yīng)：

⑴ 組織固定不當(dāng)或固定時間過長；

⑵ 抗體效價過低或久置失效；

⑶ 組織中抗原被粘稠基質(zhì)或分泌物阻隔；

⑷ DAB或H₂O₂的濃度不當(dāng)。 

五、免疫組織化學(xué)在腫瘤診斷和鑒別診斷中的應(yīng)用

（一)在腫瘤診斷中應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色的原因

１．在常規(guī)病理活檢中,通常有５～１０％的疑難病例不能明確診斷。

２．形態(tài)結(jié)構(gòu)相似的腫瘤可為不同的組織來源（如未分化癌和惡性淋巴瘤)因而難于識別，給治療帶來困難。  

３．一些轉(zhuǎn)移性腫瘤常常缺乏特有的組織學(xué)特征，因而無法確定其原發(fā)病灶（如甲狀腺癌和前列腺癌)。 

４．通過一些反映細(xì)胞增殖和與腫瘤惡性程度有關(guān)的標(biāo)記物協(xié)助識別腫瘤的良惡性。

（二)各種不同組織及其腫瘤常見的標(biāo)記物

免疫組織化學(xué)最突出的優(yōu)點是能在微觀世界原位地確定組織及細(xì)胞結(jié)構(gòu)的化學(xué)成分，由于其方法簡便且可重復(fù)性強，目前已得到廣泛的應(yīng)用，并正繼續(xù)向著更微細(xì)、更精確的原位分子雜交和免疫電鏡方向發(fā)展，向著分子病理學(xué)的領(lǐng)域推進(jìn)。

表18-1 各種不同組織及其腫瘤常見標(biāo)記物

第三節(jié) 電子顯微鏡技術(shù)

電子顯微鏡（electron microsocope)簡稱電鏡，是以電子束為照明源，通過電子流對生物樣品的透射以及電磁透鏡的多級放大后的熒光屏上成像的大型精密儀器。按工作原理和用途的不同可分為透射式電鏡（transmission electronmicroscope, TEM)和掃描式電鏡（scanning electron microscope, SEM)二種基本類型。

一．透射式電鏡

主要用于觀察細(xì)胞內(nèi)部的微細(xì)結(jié)構(gòu)，由于電子的穿透力較弱，故用于透射電鏡觀察的標(biāo)本必須切成50~100nm的超薄切片。換句話說，一個細(xì)胞要被切成100~200個薄片才適于在透射電鏡下觀察。樣品在被超薄切片之前，一般要經(jīng)過固定、脫水和包埋等處理，在切片之后還要經(jīng)過染色等處理才能進(jìn)行觀察。

超薄切片術(shù)（techniques of ultrathinsection)是最基本的電鏡樣品制備技術(shù)，其基本過程同石蠟切片大體相似，包括取材、固定、漂洗、脫水、滲透與聚合、切片和染色等多個環(huán)節(jié)，但操作過程比石蠟切片更為細(xì)致與復(fù)雜。為了獲得理想的超薄切片，操作者必須認(rèn)真對待每一步驟，任何環(huán)節(jié)的疏忽都可能導(dǎo)致制樣的失敗。

合格的超薄切片樣品應(yīng)該達(dá)到以下基本要求：①切片的厚度應(yīng)在50nm左右，不能超過100nm，以獲得較高的分辨率和較高的反差；②切片應(yīng)能耐受電子束的強烈照射而不發(fā)生破裂、變形；③細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)保持良好，沒有明顯的物質(zhì)凝聚和丟失。

電子顯微鏡技術(shù)使病理學(xué)對疾病的認(rèn)識，從組織細(xì)胞的光鏡水平深入到細(xì)胞內(nèi)的超微結(jié)構(gòu)水平，它可觀察細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器、細(xì)胞骨架或大分子水平的變化，在疾病的病理診斷中，電鏡主要用于腎臟的細(xì)針穿刺活檢標(biāo)本，來進(jìn)行腎小球腎炎的分型。在腫瘤診斷中，電鏡在確定腫瘤細(xì)胞的組織發(fā)生、類型和分化程度上起著重要作用(圖18-6)�？筛鶕�(jù)各種腫瘤細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)特點來協(xié)助區(qū)別分化差的癌和肉瘤、各種梭形細(xì)胞惡性腫瘤、各種惡性小圓細(xì)胞腫瘤、各種神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤及惡性黑色素瘤等。其方法包括負(fù)染色技術(shù)、冷凍蝕刻技術(shù)、電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)、電鏡X射線顯微分析技術(shù)、電鏡放射自顯影技術(shù)等在疾病的研究中已得到廣泛的應(yīng)用。

二．掃描電鏡

掃描電子顯微鏡就是用聚得很細(xì)的電子束流照射要檢測的樣品表面。由于電子束與樣品的相互作用產(chǎn)生各種信息然后通過不同的檢測器接收相應(yīng)的信息，經(jīng)過處理后顯示出樣品的各種特征。

掃描電鏡具有以下特點：能夠直接觀察樣品的表面的結(jié)構(gòu)；樣品制備過程簡單，不用切成超薄切片；可以從各種角度對樣品進(jìn)行觀察；景深大，圖像富有立體感；圖像的放大范圍廣，分辨率也比較高(圖18-7)；電子束對樣品的損傷與污染程度較��；在觀察形貌的同時，還可利用從樣品發(fā)出的其他信號作微區(qū)成分分析。

采用冷凍樹脂割斷法將細(xì)胞打開，可以觀察到細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。用鑄型技術(shù)研究空腔臟器，尤其是血管系統(tǒng)復(fù)雜的立體分布。還可用鹽酸化學(xué)消化法觀察細(xì)胞的基底面及深層細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)。

第四節(jié) 共聚焦激光掃描顯微鏡技術(shù)

共聚焦激光掃描顯微鏡（confocal laser scanningmicroscopy)可以從組織細(xì)胞水平直接進(jìn)入亞細(xì)胞水平觀察，且可利用計算機及圖像處理系統(tǒng)對組織，細(xì)胞及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行斷層掃描，三維立體空間結(jié)構(gòu)再現(xiàn)，將形態(tài)學(xué)研究從平面圖像水平提高到三維立體水平，圖像清晰鮮艷；還可在觀察培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的同時，直接顯示培養(yǎng)活體細(xì)胞內(nèi)的代謝變化(圖18-8)，可以說病理學(xué)及其它形態(tài)學(xué)研究將出現(xiàn)一個全新的時代。

圖18-8  共聚焦激光掃描圖

左 體外培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞；中 花粉顆粒三維圖像;右 神經(jīng)細(xì)胞DNA含量熒光強度圖

第五節(jié) 生物芯片技術(shù)

生物芯片技術(shù)（biochip technique)是將大量具有生物識別功能的分子或生物樣品有序地點陣排列在支持物上并與標(biāo)記的檢體分子同時反應(yīng)或雜交，通過放射自顯影、熒光掃描、化學(xué)發(fā)光或酶標(biāo)顯示可獲得大量有用的生物信息的新技術(shù)。生物芯片技術(shù)包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、細(xì)胞芯片、組織芯片、以及元件型微陣列芯片、通道型微陣列芯片、生物傳感芯片等新型生物芯片�？蓪�DNA、RNA、多肽、蛋白質(zhì)、細(xì)胞、組織以及其它生物成分進(jìn)行高效快捷的測試和分析。

一、基因芯片

基因芯片(genechip)是指采用原位合成或顯微打印方法，將大量DNA探針固化于支持物表面上，產(chǎn)生二維DNA探針陣列，然后與標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交，通過檢測雜交信號來實現(xiàn)對生物樣品快速、并行、高效地檢測(圖18-9)�？勺詣印⒖焖俚貦z測出成千上萬個基因的表達(dá)情況，為基因診斷、藥物篩選以及新基因發(fā)現(xiàn)提供了有力的手段。    

圖18-9 cDNA基因芯片檢測mRNA表達(dá)

二、蛋白芯片

蛋白芯片技術(shù)的基本原理是將各種蛋白質(zhì)有序地固定于滴定板、濾膜和載玻片等各種載體上成為檢測用的芯片，然后，用標(biāo)記了特定熒光素的蛋白質(zhì)或其他成分與芯片作用，經(jīng)漂洗將未能與芯片上的蛋白質(zhì)互補結(jié)合的成分洗去，再利用熒光掃描儀或激光共聚焦掃描技術(shù)，測定芯片上各點的熒光強度，通過熒光強度分析蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用的關(guān)系，由此達(dá)到檢測多種蛋白質(zhì)及其功能的目的。如抗體芯片可排列數(shù)百種單克隆抗體，通過這張芯片，人們在一次實驗中就能夠比較幾百種蛋白的表達(dá)變化。對于診斷疾�。喝鐐魅静�、腫瘤、遺傳病等臨床工作以及信號傳導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞凋亡和神經(jīng)生物學(xué)等基礎(chǔ)研究都具有廣泛的應(yīng)用前景

三、組織芯片

組織芯片又稱組織微列陣（tissue microarray) 是將數(shù)十個 數(shù)百個乃至上千個小的組織片整齊的排列在一起到載玻片上，形成微縮的組織切片(圖18-10)。

圖18-10  組織芯片

其特點有：①體積小信息含量高.可根據(jù)不同需要進(jìn)行組合和設(shè)計；②即可用于形態(tài)學(xué)觀察也可用于免疫組織化學(xué)染色。原位雜交, FISH 等原位組織細(xì)胞學(xué)觀察和研究；③高效快速,低消耗,自身內(nèi)對照和可比性強,節(jié)時、省力、少材、高效利用庫存蠟塊腫瘤標(biāo)本的新方法。一個蠟塊可連續(xù)切片200張，以供原位分析腫瘤相關(guān)基因DNA及其表達(dá)的mRNA和蛋白質(zhì)，熒光原位分子雜交（FISH)，mRNA原位雜交、免疫組化三種方法可同時在一個芯片蠟塊的連續(xù)組織切片中應(yīng)用。

因而可提高實驗效率，一張組織芯片上可列陣數(shù)十至數(shù)百個樣本。實驗條件最大程度上保持一致，有助于減少實驗誤差。另外

一個組織芯片蠟塊可連續(xù)切200張片，可進(jìn)行許多分子標(biāo)記檢測。

最大限度地利用有限的標(biāo)本資源，尤其是少見的病例標(biāo)本，最小破損原有蠟塊。

可同時檢測一種腫瘤不同階段的基因表達(dá)狀況。能在一張片上同時看到一個腫瘤組織在原位、轉(zhuǎn)移 、復(fù)發(fā)中的基因擴增情況。

第六節(jié) 激光顯微切割技術(shù)

顯微切割（micro-desection)就是在顯微鏡下用手工或儀器采樣的方法從組織切片或細(xì)胞涂片上將所要研究的形態(tài)或表型相同的細(xì)胞從組織三維構(gòu)造中分離出來，獲得純的細(xì)胞群（pure cell population)，以備進(jìn)一步作分子水平的研究(圖18-11)。顯微切割技術(shù)的貢獻(xiàn)就是克服了組織的細(xì)胞成分非常繁雜這一重大的缺點。

一、顯微切割的方法

1．材料來源

微切割可用于福爾馬林固定石蠟包埋的組織切片、冰凍切片、培養(yǎng)細(xì)胞和細(xì)胞涂片。但所用載玻片不準(zhǔn)涂抹任何粘附劑，常用的組織切片是HE染色的常規(guī)石蠟切片（厚5μm)。

2．切割及細(xì)胞采集方法

微切割及細(xì)胞采集方法大體上可分為手工操作和儀器操作兩大類。兩者各有長短。從兩個方面評價這些方法，一是準(zhǔn)確性，即有無雜細(xì)胞污染；二是它的效率，能否在較短時間內(nèi)采集到足夠的細(xì)胞；當(dāng)然也要考慮方法所需費用。

（1)手工操作  就是用消毒的細(xì)針或刀片搔刮組織切片（厚5~15μm)上的細(xì)胞，并將其移至Eppendorf管中。

（2)儀器操作  利用激光進(jìn)行微切割和細(xì)胞采集，其特點是微切割的精度高，可進(jìn)行單個或幾個至數(shù)十個細(xì)胞的切割，可獲得很純的細(xì)胞群體，并適用于各種組織材料；再就是效率高，但儀器價格昂貴。具體又有4種不同的方法：①激光微光束微切割 ② 激光加壓彈射③貼于膜上的原組織微切割 ④激光俘獲微切割。

二、顯微切割的應(yīng)用

1．細(xì)胞基因突變及微衛(wèi)星變異的研究

2．細(xì)胞基因拷貝數(shù)的變化和甲基化水平的檢測

3．定量RT-PCR

4．比較基因組雜交

5．cDNA微陣列（芯片)

第七節(jié) 原位分子雜交技術(shù)

原位核酸分子雜交（in situ hybridization, ISH)是應(yīng)用特定標(biāo)記的已知核酸探針與組織或細(xì)胞中待測的核酸按堿基配對的原則進(jìn)行特異性結(jié)合，形成雜交體，雜交后的信號可以在光鏡或電鏡下進(jìn)行觀察。由于核酸分子雜交的特異性強、敏感性高、定位精確、并可半定量，因此該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等各個領(lǐng)域的研究之中(圖18-12)。     圖18-12肺腺癌

  β-catmRNA的表達(dá)，原位雜交

第八節(jié) 熒光原位分子雜交染色體分析技術(shù)

一、簡介（introduction)

染色體原位分子雜交技術(shù)（Chromsome Analysis byFluorescence in situ Hybridization)的發(fā)展為研究染色體上DNA的序列提供了一個最直接的方法。具有經(jīng)濟、安全、快速、穩(wěn)定，靈敏度高等優(yōu)點，多彩FISH可在同一核內(nèi)顯示兩種或多種序列，還可對間期核染色體進(jìn)行研究(圖18-13)；應(yīng)用不同的探針可顯示某一物種的全部基因，某一染色體染色片段及單拷貝序列；結(jié)合共焦激光顯微鏡可對間期核及染色體進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)研究，精確檢測雜交信號。

二、探針（probes)

1．基因組探針（genomic probe)：

人類基因組內(nèi)一些高頻率的重復(fù)序列，在進(jìn)化上很少具有保守性。若以基因組DNA作為探針，這些存在于探針和靶細(xì)胞順序中的高度重復(fù)序列之間會首先退火結(jié)合，越過那些保守的和單一的序列，故雜交會呈現(xiàn)出種特異性。利用這類探針在人鼠雜交細(xì)胞中可特異顯示人的遺傳物質(zhì)。

2．染色體特異性序列探針（probe recognizing chromosome specificsequences)：

目前在人幾乎所有染色體中已經(jīng)克隆出一些重復(fù)序列，重復(fù)一百到五千次不等，各具染色體特異性。大多在某一染色體的著絲粒區(qū)或異染色質(zhì)區(qū)產(chǎn)生致密的雜交帶。從而可特異性地識別某一染色體。

3．染色體文庫探針（chromosomelabraries probe)：

染色體文庫收集人類單條染色體的DNA作為探針，又稱整體染色體探針。單條染色體的獲得一般有兩種方法：來自僅攜有某一條人類染色體的體細(xì)胞雜交株，或經(jīng)流式細(xì)胞分類儀從染色體懸液中分離

4．單一序列探針（single-copysequences probe)： 

  FISH有一弱點，就是要求探針足夠大，探針越小，雜交位點檢出率就越低。欲利用FISH檢測存在基因組內(nèi)的單一序列基因，最有效的方法是應(yīng)用含大插入片段的克隆載體，如全Cosmids（載約40kb的插入片段)，更大的YAC載體（載100-800kb插入片段)。若掌握好，小到2kb的質(zhì)粒探針亦可用FISH方法定位，但效率較低。

三、FISH技術(shù)系列

1．24色mFISH核型分析技術(shù)

24色mFISH是近年建立的一種新技術(shù)。其原理是使用5種熒光染料按比例標(biāo)記探針，雜交后形成24條染色體各自呈現(xiàn)特異的熒光色彩以供核型分析(圖18-14)。為研究人員提供了更豐富詳盡的細(xì)胞遺傳學(xué)信息，包括確定標(biāo)記染色體的來源、檢測微小的染色體易位和檢測復(fù)雜的染色體易位，尤其為腫瘤細(xì)胞染色體分析提供了全新、高效的方法 。

2．原位雜交顯帶技術(shù)(in situ hybridizationbanding,ISHB)

為了準(zhǔn)確定位原位雜交部位所處染色體及其區(qū)帶，染色體必須顯帶。但無論是先雜交后顯帶，還是先顯帶后雜交，雜交與顯帶過程會互相影響效果。后來人們注意到，人類短間隔插入重復(fù)序列中的一種Alu家族，Alu片段約300bp長，在基因組中重復(fù)約九十萬次，平均間隔3-4kb就插入一個。有人利用部分Alu序列作為引物，用PCR方法擴增Alu之間的DNA，稱Alu-PCR法。但Alu序列在基因組內(nèi)分布不是隨機的，有些區(qū)域比較密集，有些區(qū)域較稀疏。只有前者才有PCR產(chǎn)物。人們用Alu-PCR產(chǎn)物作為探針與人類染色體標(biāo)本雜交，結(jié)果得到類似R帶的熒光帶型。故人們在進(jìn)行基因定位時，只需將目的探針與Alu-PCR探針同時應(yīng)用，用不同顏色的熒光標(biāo)記，就可同時顯示雜交信號和染色體帶型。

3．FISH基因定位（FISH mapping)

基因定位時，不但需要確定某段靶序列在染色體上的位置，尚需確定兩個或兩個以上靶序列在線性DNA分子的排列次序和距離，才能繪出基因圖。一般用同位素雜交：先確定每一靶序列在中期染色體上的位置，然后根據(jù)它們到端粒的距離確定出線形排列次序。而用FISH方法，兩種或兩種以上的探針能同時與中期染色體雜交，只要根據(jù)兩種顏色雜交位點的相互位置，就能直接確定次序。但中期染色體是線形DNA分子經(jīng)過折疊和包裝后形成的，若兩個靶序列相距很近，例如間距小于1Mbp，受包裝過程的影響，它們在線形DNA分子上的排列與在中期染色體上的排列不一定相同，甚至可能完全相反。學(xué)者們發(fā)現(xiàn)，靶序列之間在間期核的平均相對距離與它們在線形DNA分子上的距離呈正相關(guān)。利用間期核FISH分析不但能排除染色體包裝的影響，還能提高測距的分辨率(圖18-15)。

4.FISH的應(yīng)用

(1)基因定位與基因制圖（genemapping) 原理前面已敘述。FISH已經(jīng)極大地加速了人類基因定位和基因制圖的進(jìn)程。

(2)基因診斷(genediagnosis) 精確、直觀、明了

(3)間期細(xì)胞遺傳學(xué)（interphasecytogenetics)

(4)FISH在腫瘤生物學(xué)中的應(yīng)用 

①腫瘤細(xì)胞遺傳學(xué)（onco-cytogenetics)；②基因定位：FISH可用于分離出的癌基因與抑癌基因初步定位；③病毒基因插入基因組部分的檢測：雖然逆轉(zhuǎn)錄病毒以激活原癌基因為主，也有像腺病毒、HPV、SV40等病毒以蛋白產(chǎn)物與抑癌基因蛋白產(chǎn)物相互作用而誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。但病毒基因特別是DNA病毒多有病毒基因成分插入到人基因組。利用FISH可以檢測到病毒整合到人基因組中的情況，對深入研究病毒致癌機理，以及檢測、防治腫瘤均具有重要意義；④基因的擴增與缺失：原癌基因的激活與抑癌基因的失活是目前腫瘤研究的熱點。已知原癌基因的激活方式有：突變、基因擴增、易位、病毒序列插入。抑癌基因的失活方式有：點突變、基因缺失。FISH為研究基因的擴增和缺失提供了新的方法，能將基因擴增和染色體重復(fù)分開。

第九節(jié) 比較基因組雜交技術(shù)

比較基因組雜交技術(shù)(comparative genomehybridization,CGH)。

圖18-16   食管癌細(xì)胞系CGH圖

其基本原理是用不同的熒光染料分別標(biāo)記正常人基因組DNA與腫瘤細(xì)胞DNA，然后與正常人中期染色體雜交，通過檢測染色體上兩種熒光（紅、綠)的相對強度比率，兩組DNA相異部分會顯出顏色偏移，可計算出DNA的缺失與放大，從而了解腫瘤組織DNA拷貝數(shù)的改變，并能同時在染色體上定位(圖18-16)。這樣的方法使我們只要從新鮮組織或石蠟包埋腫瘤組織中提取少量DNA，就可進(jìn)行全基因組檢測。應(yīng)用CGH技術(shù)檢測癌變過程中的不同階段，腫瘤進(jìn)展的不同時期及不同類型腫瘤的非隨機性染色體改變，有助于從分子細(xì)胞遺傳學(xué)角度了解腫瘤的發(fā)生發(fā)展，對發(fā)現(xiàn)腫瘤遺傳學(xué)標(biāo)記，初步查尋腫瘤相關(guān)基因的位置均具有重要意義。其對檢測原癌基因擴增較為靈敏，但對檢測基因缺失敏感性則相對較弱。

第十節(jié) 流式細(xì)胞技術(shù)

流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry, FCM)是一種單細(xì)胞定量分析和分選的新技術(shù)，可對單個細(xì)胞逐個地進(jìn)行高速準(zhǔn)確的定量分析和分類。

流式細(xì)胞儀的主要工作原理是讓熒光染色細(xì)胞在穩(wěn)定的液流推動裝置作用下通過直徑為50~100m的小孔并排列成單行，每個細(xì)胞依次而且恒速通過激光束的照射區(qū)，細(xì)胞受激光照射后發(fā)生散射光和熒光。通過檢測散射光可知細(xì)胞的體積，檢測熒光可知細(xì)胞DNA或RNA的含量。細(xì)胞樣品被檢測后即形成一連串均勻的液滴，其形成速度約每秒3萬個，而細(xì)胞通過小孔（噴嘴)的速度在每秒2000個以下。由此計算，平均每15個液滴中有一個液滴包有細(xì)胞，而其它液滴無細(xì)胞。由于液滴中的細(xì)胞是已被測定的細(xì)胞，因而，如其特性與被選定要進(jìn)行分選的細(xì)胞特性相符，則儀器在含有這個細(xì)胞的液滴形成時就使其帶有特定的電荷；否則，液滴不帶電荷。帶有電荷的液滴向下落入偏轉(zhuǎn)板的高壓靜電場時，依據(jù)自身所帶電荷性質(zhì)發(fā)生向左或向右偏轉(zhuǎn)，落入各自的收集容器中。不帶電荷的水滴就進(jìn)入中間廢液容器，從而實現(xiàn)細(xì)胞分選的目的。

因此流式細(xì)胞計可同時檢測單個細(xì)胞DNA、RNA、細(xì)胞體積等參數(shù)，進(jìn)行細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡的研究；并可分析細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)的各種抗原、蛋白、酶、細(xì)胞因子和粘附分子以及基因表達(dá)產(chǎn)物；還可在無菌條件下，以高速對活細(xì)胞進(jìn)行分類收集，其純度達(dá)90~99%。此外還可應(yīng)用于酶活性、細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞膜受體、表面電荷、細(xì)胞內(nèi)pH、細(xì)胞和線粒體膜電位、細(xì)胞漿和膜結(jié)合的鈣離子、膜的完整性、流動性、通透性或微粘度等功能研究。

第十一節(jié) 組織培養(yǎng)與細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

組織與細(xì)胞培養(yǎng)(tissue and cell culture)是將活體內(nèi)部分組織細(xì)胞取出后在人工條件下使其生長，繁殖和傳代。在體外對細(xì)胞進(jìn)行生命活動、細(xì)胞癌變等問題研究。還可施加實驗因子進(jìn)行形態(tài)、生化、免疫、分子生物學(xué)觀察，已廣泛應(yīng)用于病理學(xué)的各個研究領(lǐng)域。

原代培養(yǎng)：由體內(nèi)直接取出組織或細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。優(yōu)點：離體時間短，遺傳性和體內(nèi)組織相似。宜作細(xì)胞形態(tài)、機能和分化研究。

傳代培養(yǎng)：把細(xì)胞自原代培養(yǎng)的培養(yǎng)瓶中分離、稀釋而移至另一新的培養(yǎng)瓶中的操作程序即為傳代或再培養(yǎng)。以便持續(xù)培養(yǎng)，得到大量同種細(xì)胞，或建成細(xì)胞株，維持細(xì)胞種延續(xù)(圖18-17)。