三、凝集素在免疫細(xì)胞化學(xué)中的應(yīng)用
凝集素可為熒光素、酶和生物素等所標(biāo)記，分別進(jìn)行下列染色法：
1．直接法 標(biāo)記物直接標(biāo)記在凝集素上，使之直接與切片中的相應(yīng)糖蛋白或糖脂相結(jié)合。
（1)切片脫蠟至水。
�。�2)凝集素標(biāo)記物（100μg/ml)，室溫，30min。
�。�3)TBS洗3次，每次2min。
�。�4)如為熒光素標(biāo)記物，封片用熒光顯微鏡觀察。如為酶標(biāo)記物，則應(yīng)依次進(jìn)行呈色、脫水、透明和封固后在光學(xué)顯微下觀察。醫(yī).學(xué)全.在.線m.zxtf.net.cn
直接法的優(yōu)點(diǎn)是簡便，目前商品用的凝集素藥盒已能購得。但靈敏性不夠高。
2．間接法 將凝集素直接與切片中的相應(yīng)糖基結(jié)合，而將標(biāo)記物結(jié)合在抗凝集素抗體上。
�。�1)脫蠟至水。
�。�2)用含3%的H2O2的甲醇阻斷內(nèi)源性過氧化物酶10min。
（3)凝集素稀釋液（100μg/ml)孵育30min。
�。�4)TBS洗3次，每次2min。
�。�5)用標(biāo)記了的抗凝集素抗體（1：100)孵育30min。
（6)TBS洗3次，每次2min。
（7)呈色、脫水、透明、封片。
�。�8)觀察。
間接法染色還可進(jìn)一步改良為：①三步法：即在凝集素孵育后，接著用抗凝集素抗體孵育，再用標(biāo)記了的抗-抗凝集素抗體孵育，層層放大，進(jìn)一步提高其敏感性，PAP復(fù)合物也可作為標(biāo)記物標(biāo)記在抗-抗凝集素抗體上。②抗生物素—生物素凝集素法：用結(jié)合了生物素的凝集素孵育切片后，TBS洗后再以抗生物素—標(biāo)記物與之結(jié)合。間接法較直接法和直接法敏感性高5～10倍或更多一些，但必須購買或自制抗凝集素抗體。
3．糖—凝集素—糖法 本法是利用過量的凝集素與組織切片中特定的糖基相結(jié)合。經(jīng)沖洗后，凝集素上還存在未被占用的結(jié)合部位，將這些部位與有過氧化物酶標(biāo)記的特異性糖基相結(jié)合，形成一個(gè)三明治樣的糖—凝集素—糖的結(jié)合物。
�。�1)脫蠟至水。
（2)用含3%的H2O2的甲醇阻斷內(nèi)源性過氧化物酶10min。
（3)用100μg/ml的凝集素孵育30min。
�。�4)TBS洗3次，每次3min。
�。�5)用100μg/mlHRP標(biāo)記的糖液孵育30min。
�。�6)TBS洗3次，每次3min。
（7)DAB呈色、脫水、透明、封固。
本法特異性強(qiáng)，靈敏度高，因?yàn)檫@不象生物素—抗生物素法那樣要改變凝集素，又不需要像抗體那樣要制備抗體。HRP本身含有甘露糖，能與刀豆凝集素A、扁豆凝集素和豌豆凝集素結(jié)合。但對其它的凝集素，本法目前普及還有一定困難，因?yàn)橐獙⑦^氧化物酶結(jié)合到其它凝集素上，就需要將一個(gè)適當(dāng)?shù)奶妓衔锘鶊F(tuán)嵌入過氧化物酶，稱為糖基化（glycosylation)，方法雖不復(fù)雜（Lee 等1976)，但需一定的試劑和設(shè)備。商品化能提供的糖基化過氧化物酶品種尚有限。
【注意事項(xiàng)】
�、倌匦枰亟饘匐x子維持其活躍的結(jié)合部位，如果金屬離子耗盡了，就會(huì)影響凝集素的結(jié)合能力。因此，有作者主張用TBS作為緩沖液，內(nèi)加微量的金屬，配方是：Tris 60.57g,NaCl87g, H2O加至1000ml，其中含CaCl2、MgCl2各1.0mmol/L�；蛟谶M(jìn)入凝集素孵育前，先用該液孵育，以增強(qiáng)凝集素結(jié)合力。
�、诤推渌贵w血清應(yīng)用一樣， 應(yīng)用每批新的凝集素實(shí)驗(yàn)時(shí)，都先要用緩沖液稀釋成不同等級；如8，16，32，64，125，250，500，1000μg/ml，經(jīng)染色選擇最佳稀釋度。
�、塾凶髡哒J(rèn)為阻斷組織內(nèi)源性過氧化物酶所用的H2O2對碳水化合物有影響，可能改變凝集素的結(jié)合形式，因此，應(yīng)盡量少用或不用，我們及一些作者在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)影響不明顯。
�、苡凶髡哒J(rèn)為凡經(jīng)固定的組織切片，不論是石蠟包埋切片或冰凍切片，都有可能使組織中抗原隱蔽，為了暴露隱蔽了的碳水化合物基團(tuán)，主張?jiān)谀胤跤坝妹柑幚砬衅�，常用胰蛋白酶液（配制見附�?進(jìn)行適當(dāng)?shù)姆跤?/P>
�、菀阎溉閯�(dòng)物的質(zhì)膜含有占蛋白總量的1%～10%的碳水化合物，它們以低聚糖（oligosacchride)糖脂，并主要以糖蛋白的形式存在，糖蛋白線性的或分支的旁鏈可能含有兩個(gè)到多個(gè)單糖殘基，通常有兩種或更多的單糖，在單糖單位末端常常是一個(gè)帶負(fù)電荷的N-乙酰神經(jīng)氨酸的殘基，一個(gè)唾液酸（siallic acid)。有作者在凝集素實(shí)驗(yàn)中常用神經(jīng)氨酸酶(neuramidinase)分解細(xì)胞表面的唾液酸或神經(jīng)氨酸，以暴露出隱蔽的能與聚集素結(jié)合的次終末的碳水化合物。配制方法是將神經(jīng)氨酸酶（Type V,Sigma Lot 63F—8172 63F--8172)用醋酸緩沖液（含2%牛血清白蛋白)BSA配成0.5μg/ml。
切片脫蠟后進(jìn)行酶消化的過程中，將該組織切片置于上述配制液中，在濕盒內(nèi)，37℃孵育30min。用緩沖液洗后，進(jìn)行凝集素染色。
�、迣φ赵囼�(yàn)，和其它組化染色一樣，凝集素染色也需要設(shè)對照試驗(yàn)（最好在相鄰切片進(jìn)行)。由于凝集素具有單糖特異性，如果外加相應(yīng)的糖，把凝集素的結(jié)合部位占有了，凝集素就不能再與組織中的糖基相結(jié)合了。一般采用的方法是將凝集素預(yù)先與相應(yīng)的糖（0.2mol/L)在室溫孵育30min，使之占有凝集素結(jié)合部位，再將此液代替凝集素進(jìn)行孵育，結(jié)果應(yīng)為陰性。在某些情況下即使提高糖液的濃度也不能達(dá)到完全的抑制。這時(shí)，只有用與凝集素有高親合力的低聚糖（oligosachrides)代替或?qū)⑶衅A(yù)先用相應(yīng)的糖苷酶孵育去除特異性糖基（Watanalte等，1981)。
